基于多区域单细胞测序揭示肝癌组织中肿瘤细胞与免疫细胞钥锁特性

期刊：nature communications（17.694）
技术服务：scRNA-Seq测序

导语
肿瘤内异质性作为研究肿瘤分子特征不可回避的话题，肿瘤细胞的进化及肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）的持续作用都有可能导致肿瘤异质性的出现。由于肿瘤的进化伴随着肿瘤细胞和TME的持续相互作用，因此定义细胞特征及其潜在的分子通信网络(它们塑造了肿瘤生态环境，从而推动了肿瘤的进化)可能是提高对肿瘤生态系统的分子理解和开发有效的实体肿瘤治疗方法的关键。现有大量研究也表明，肿瘤内异质性与病人预后也存在很大的相关性。

理论假设
本文作者认为，每个肿瘤生态系统都可能代表了肿瘤细胞在特定的选择压力下促进肿瘤进化的肿瘤-基质相互作用网络的独特组合，因此，肿瘤细胞和基质/免疫细胞间的互作代表着该状态下肿瘤生物学的特定指纹特征。这一特征类似描述酶-底物相互作用的锁-钥匙模型。

实验思路
本文作者对七个病人组织样本进行单细胞测序（4例HCC和3例ICCA），研究恶性细胞的动态以及恶性细胞与肿瘤相关免疫细胞间的通讯网络，使用额外的25例HCC和12例iCCA患者的scRNAseq数据进行验证，并将一些显著的受配体对在额外收集的542例HCC病人转录组数据中验证。

设计亮点：目前大量研究主要依赖于对肿瘤组织单个区域取样获得的活检样本，探索其细胞组成。很可能受到取样位置的影响。本研究采取对每个病人多区域取样做单细胞检测降低由于取样偏差带来的影响。结果表明，肿瘤异质性明显存在，但无论肿瘤细胞组成还是肿瘤细胞和肿瘤微环境的信息交流的变化肿瘤内部的变化小于肿瘤间的变化。

主要结果
本文共收集七个病人的样本，每个病人分别取五个位置获取活检样本（分别命名为B、N、T1、T2、T3；其中3CT3样本建库失败），共34个样本进行单细胞测序。
 

以正常肝组织作为对照，采用inferCNV识别肿瘤恶性细胞，将检测到恶性细胞数目大于10的样本纳入后续恶性细胞分析，共保留来自六个患者（1H、2H、3H、4H、1C、3C）的数据，如下：
 

1. 探究肿瘤区域间异质性
对来源于各患者不同区域肿瘤恶性细胞t-SNE降维聚类结果显示，恶性细胞倾向于聚成患者特异的cluster，且患者间异质性要高于区域间异质性。层次聚类结果显示，来源于同一个患者的各区域肿瘤细胞倾向于聚在一起，且与肿瘤大小无显著关联。本文进一步比较了来源于同一患者不同肿瘤区域的组织学特征，发现肿瘤区域间具有显著差异。
 

为了进一步定量评估区域内的异质性，文章计算了同一取样区域内恶性细胞间的相关性，和不同区域各恶性细胞间的相关性，结果表明同一区域内和来源于同一患者各区域间的相关性远高于不同患者间相关性。
 

对上皮细胞t-SNE降维聚类结果显示，恶性细胞表现出样本特异性的表达模式，而来源于不同样本正常组织的上皮细胞混在一起，共享相同的表达模式。
 

文章进一步计算了肿瘤核心位置和边缘位置肿瘤异质性比例和肿瘤大小关系、肿瘤区域间异质性均值和肿瘤大小关系、肿瘤内细胞间相关性和肿瘤大小关系，结果表明，虽然肿瘤大小和组织学特征可能在患者之间有所不同，但患者内部各肿瘤细胞转录组活性的差异要比患者之间的差异小得多。
 

为了评估与转录组异质性相关的不同区域的恶性细胞的细胞状态，文章进行RNA速率分析，并分析与细胞增殖相关的四个干性基因的表达情况，结果表明虽然不同干性基因表达出明显的异质性，但其在恶性细胞的表达在肿瘤的不同区域却呈现相似的细胞轨迹。
 

文章采用荧光激活分选的方法（FACS）筛选EPCAM+ 细胞和 GPC3+ 细胞，已知这两种marker在肿瘤细胞中显著表达。结果显示EPCAM+或GPC3+细胞在肿瘤核心区域的比例相对稳定，但与肿瘤边缘区域相比存在差异。免疫组化结果显示SPP1基因表达在肿瘤细胞中显著升高。
 

2. 识别多区域间肿瘤-免疫通讯网络
文章以CellPhoneDB方法识别恶性细胞与TME间的受配体互作对，进一步探索在患者内部多区域高度保守的病人特异互作网络。结果显示，基于分子层面的通讯网络在采样区域间表现较好的稳定性，在病人间展现高度特异性，且在HCC患者中稳定性好于ICCA组患者。文章采用随机洗牌的方式评估肿瘤细胞和TME对患者特异性受配体的贡献率，结果表明每种肿瘤在肿瘤细胞和TME之间可能包含相对稳定但独特的通信网络，其中恶性细胞在患者特异性模式中起主导地位。
 

3. 识别与患者临床特征相关的分子特征
文章将基于单细胞数据得到受配体对在包含生存数据的542HCC三套数据集的常规bulk转录组数据中验证其与生存相关性，得到各样本受配体对表达图谱，基于层次聚类结果显示，样本被分为具有不同互作模式的两组，且两组肿瘤样本总体生存期存在显著差异。文章发现GALS9-SLC1A5 和SPP1-PTGER4 受配体在三套数据集中高度一致且在组内特征贡献较大。进一步表明互作网络是HCC侵袭性的一个稳定特征，类似于锁-钥匙特征酶和底物的相互作用的肿瘤-免疫/基质相互作用对的独特组合可以作为肿瘤侵袭性的分类器。
 

为进一步验证受配体相互作用与HCC预后相关的稳健性，文章采用多重荧光原位杂交的方法验证两个关键受配体对(LGALS9-SLC1A5 和SPP1-PTGER4) 。结果显示受配体对相关的四个基因共定位于某些特定肿瘤区域，而非整个肿瘤空间，且来源同一受配体对的基因表达倾向于一致。两个受配体对均高表达的患者总体生存期明显低于低表达组，即两个受配体对稳定高表达的HCC患者表现出较差的预后。
 

结论
文章通过多区域单细胞测序探究肿瘤各区域内和区域间异质性，进一步评估肿瘤细胞和肿瘤微环境对整个肿瘤生态贡献，且识别出与患者预后显著相关的分子特征。本研究揭示了恶性生态系统的稳定分子网络，为恶性生态系统的治疗探索开辟了新的途径。

参考文献：
Ma, L., Heinrich, S., Wang, L. et al. Multiregional single-cell dissection of tumor and immune cells reveals stable lock-and-key features in liver cancer. Nat Commun 13, 7533 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35291-5