利用荧光法检测蛋白浓度的两种方式
蛋白质定量是许多蛋白质生物学工作流程的重要组成部分，是蛋白质电泳、蛋白质印迹、质谱和免疫分析等常用技术之前的必要步骤。与传统的BCA、Bradford等比色法测蛋白的方式相比，荧光法测蛋白动态范围更宽、准确性更高。
蛋白质定量是许多蛋白质生物学工作流程的重要组成部分，是蛋白质电泳、蛋白质印迹、质谱和免疫分析等常用技术之前的必要步骤。与传统的BCA、Bradford等比色法测蛋白的方式相比，荧光法测蛋白动态范围更宽、准确性更高。
试剂及仪器
• Qubit™ Protein Assay Kits（Thermo：Q33212）
• Qubit 4荧光计（Thermo）
• Fluo-200荧光计（奥盛）
• Feyond-A300多功能酶标仪（奥盛）
方法
• 标品配置
| 加样体积 | 10μL |
| 标品配制 | 将试剂盒中最高浓度的400ng/uL蛋白标品稀释配制成300、200、100、50、25、12.5ng/uL共6个浓度，试剂盒浓度范围在12.5 µg/mL 到 5 mg/mL。 |
• 操作步骤
1.根据试剂说明书，制备染料Mix工作液及0、200及400ng/uL校准点试剂，校准曲线完成后，分别在Qubit4与Fluo-200上进行检测；
表1 Feyond-A300参数
| 试剂波长 | EX/EM：470/525 |
| PMT增益 | 中低 |
| 稳定时间 | 150ms |
| 积分时间 | 40μs |
图1. 样品布局界面
结果
1.利用Feyond-A300的内置数据处理软件，将蛋白标品浓度与荧光强度进行标准曲线拟合，采用四参数（4PL）拟合方式，得到曲线方程与曲线拟合度，R2接近为1（图2）。
图2. 蛋白标准曲
2.浓度范围在12.5 ng/uL~400ng/uL时，Fluo-200与Qubit4的检测浓度偏差均在10%以内，是Qubit的合理偏差。除接近极限浓度的最低点外，Feyond-A300的检测浓度与Qubit4相比也在合理偏差内，且与理论浓度更为接近（表2）。
表2 三款仪器的检测数据
| 理论浓度 | Qubit4 | Fluo-200 | Feyond-A300 |
| 12.5 | 20 | 19.11 | 8.023 |
| 25 | 33.2 | 30.59 | 29.319 |
| 50 | 50.6 | 46.16 | 50.626 |
| 100 | 95.2 | 92.94 | 101.835 |
| 200 | 184 | 192.39 | 197.206 |
| 300 | 286 | 299.71 | 302.978 |
| 400 | 400 | 401.22 | 398.596 |
总结
Qubit 荧光检测蛋白试剂盒，不仅在Qubit仪器上可以适用，也可在Feyond-A300的荧光检测功能上适用，并且准确性基本无差异，荧光计检测无需建立标准曲线，仅需进行标品点的校准，便可直接进行浓度的测试，简单便捷。Feyond-A300的标曲保存功能，亦可满足该需求，仅需一次建立标曲后，将标曲保存于标曲库，后续仅需调取该标曲便可直接给出未知样品的浓度。
