荧光定量PCR基础知识小课堂（一）
01 常规PCR和荧光定量PCR的区别是什么呢？
聚合酶链式反应(PCR)：一种对特定的靶核酸片段在体外进行快速扩增的方法。通常由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成，通过不同温度的循环实现靶核酸的扩增。
实时荧光定量PCR (Real-time qPCR) 是在PCR技术基础上发展起来的核酸/基因检测技术，是一种在PCR反应体系中加入荧光标记探针或荧光染料，通过采集荧光信号出现的先后顺序以及强弱的变化，搭配软件分析Ct值和标准曲线，对目的基因进行定性或定量分析的方法。
02 荧光定量PCR反应体系的组成都有什么呢？
荧光定量PCR反应体系包括：核酸模板、引物、热稳定DNA聚合酶、四种dNTP、荧光染料或Taqman探针以及含有Mg2+ 等的缓冲液。一般配置20μL或50μL体积的反应体系。
核酸模板
通常配置20 μL反应体系时，模板的使用量小于100 ng，逆转录产物作为模板时，模板量不超过体系终体积的20%。模板进行逆转录实验，常用于基因表达的检测，在材料收集过程中，样本需要立刻液氮速冻，并迅速转移到超低温冰箱保存，尽量避免RNA的降解。一般将实验材料分为对照组和处理组，组内要有3组以上重复，以便后续对偏差较大的数据进行处理。
DNA聚合酶
在进行荧光定量PCR实验时，需要选择合适的耐热聚合酶，具体需参考酶的特异性、保真性、耐热性、扩增速率等多个指标。目前市面上较常用的是Taq DNA聚合酶，其他还有Vent系列、KOD系列、Pfu系列等多种类型的DNA聚合酶。
引物
是指人工合成的两段寡核苷酸序列，其中一个引物与对应的DNA模板链目标区域3’端的碱基互补，另一个引物与另一条DNA模板链目标区域5’端的碱基互补。
脱氧核苷三磷酸（dNTP）
dNTPs是dATP、dGTP、dTTP、dCTP的统称。dNTPs作为DNA复制原料，它直接影响扩增产物的产量、特异性以及保真性，因此在实验过程中需要选择浓度准确、纯度高的试剂。
缓冲液
缓冲液的作用是为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。通常缓冲液的pH为8.0-9.5，改变pH会影响核酸扩增量。另外缓冲液的关键组分Mg2+是酶工作所必需的离子，与 dNTPs 和模板螯合在一起，成为 DNA 聚合酶识别的底物。目前市面上的常用的缓冲液一般是2×的浓缩液，按照说明书的添加量配置即可。
荧光团基
荧光化学物质可分为：荧光染料和荧光探针。
荧光染料以SYBR Green为代表，与DNA小沟区域非特异性结合，每形成一条双链，就有染料与双链DNA结合。通过光源激发染料产生荧光信号，荧光信号强弱与DNA双链数量成正比。
荧光探针的发光机制与染料不同，利用的是一对能产生荧光共振能量转移的基团，即5′端的报告基团和3′端的淬灭基团。探针完整时，报告基团的荧光信号被淬灭基团所淬灭，扩增时，5'端外切酶活性将探针水解切割，报告基团和淬灭基团分离，荧光信号开始积累。
总的来说，荧光定量PCR作为核酸定量常用的检测方法，体系配置简单，适用范围广泛。在进行qPCR实验时，不管是选择荧光染料还是荧光探针，检测方法都很有效，可以根据本身材料情况，选择适合的方法。
Esan-Gene 162/164
