RT-PCR的原理与操作步骤

RT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。

一、 RT-PCR的原理：
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

二、RT-PCR的步骤：
1、在冰浴离心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去离子水5uL，混匀，离心3-5秒；
2、70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；
3、加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1uL，dNTP 2uL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；
4、37度水浴5分钟，加入1uL AMV-RT反转录酶，混匀；
5、37度水浴1小时（此步是反转录过程）；
6、70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。