AbbVie靶向蛋白降解IRAK3靶点成药性研究进展讲解
白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs)蛋白家族由IRAK1、IRAK2、IRAK3（IRAK-M）和IRAK4四种同工酶组成，介导白细胞介素1受体（IL-1R）和Toll样受体（TLR）信号通路。活化的TLR/IL1R导致Myddosome组装，这是一种由MyD88、IRAK4和IRAK2组成的多蛋白复合物，它通过 IRAK4 依赖性磷酸化激活丝氨酸/苏氨酸激酶 IRAK1。IRAK1 与 E3 泛素连接酶 TRAF6 结合，后者介导 IKK 复合物的激活，导致 NF-κB 靶基因的转录。IRAK1/TRAF6 复合物还可以通过组装具有催化活性的 TAB2-TAB3-TAK1 复合物来激活 JNK 和 p38 信号传导。在单核细胞和巨噬细胞中，IRAK3 通过抑制 IRAK4 和 IRAK1 的激活负向调节 IRAK 信号传导。
IRAK1和IRAK4是组织中广泛表达的经典激酶，而IRAK3是一种假激酶，只在骨髓细胞系中表达，缺乏激酶活性。迄今为止，没有传统小分子抑制剂靶向IRAK3，2020年，Degorce等报道了第一个选择性降解IRAK3靶点的PROTAC分子，但相关研究没有揭示降解后功能变化。IRAK3作为TLR通路的负调控因子，可能会降低先天免疫反应。在肿瘤微环境中，敲除IRAK3显示骨髓细胞功能增强以促进抗肿瘤响应。与肿瘤细胞共培养的单核细胞显示 TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表达降低，但 IRAK3 表达增加。相反，与野生型 (WT) 树突状细胞（DCs） 相比，IRAK3-/-小鼠树突状细胞的促炎细胞因子表达增加，从而诱导 T 细胞反应并导致肿瘤生长抑制，降解IRAK3可能成为免疫肿瘤治疗中一个有吸引力新策略。IL-12是由活化的树突状细胞和巨噬细胞产出的主要促炎细胞因子，通过诱导促IFN-γ细胞因子，在促进Th1介导的抗肿瘤反应、T细胞活化和增殖中发挥重要作用。
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和PROTAC选择性降解IRAK3来研究后续DCs中功能和表型变化。根据下图在人单核细胞衍生的树突状细胞中基因编辑敲除IRAK3基因，采用基于毛细管电泳技术的Digital Western（也称为Simple Western Wes系统）验证基因敲除效率，2个供体显示完全敲除，另一个显示保留10% IRAK3蛋白表达，结果显示通过CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表达水平。敲除了IRAK3后，在脂多糖（LPS）刺激后，通过检测细胞上清液中细胞因子分泌水平，结果显示IL-12p40分泌显著增加，与对照相比，浓度增加了1.5到2倍。同时IL-12p70分泌也具有增长趋势，但IL-10没有影响。
采用PROTAC D-1和LPS处理的DCs中IL-12p40浓度增加与CRISPR/Cas9 KO实验结果一致的，证明了两种方法有效性，证明通过PROTAC蛋白降解剂对IRAK3靶点可成药性。通过深入了解研究IRAK3生物学，扩大了PROTAC分子降解靶点库，并支持了潜在治疗靶点的基因编辑缺失和化学降解之间的相关性。
本研究主要利用Digital Western Blot技术检测IRAK3靶蛋白表达水平，研究CRISPR/Cas9基因编辑技术和PROTAC蛋白降解技术处理后细胞蛋白表达，准确定量靶向蛋白降解研究过程量效关系。AbbVie公司研究再次证明了Digital Western Blot可快速地、可重复性精准定量内源性蛋白质表达，是PROTAC技术平台构建的必备技术。
PROTAC 是 Arvinas, Inc. 注册商标，其他商标和注册商标是其各自所有者的财产。
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参考文献
1. Rhyasen, G., Starczynowski, D. IRAK signalling in cancer. Br J Cancer 112, 232–237 (2015).
2. Ann Rowley, Brian S Brown, etc. Targeting IRAK3 for Degradation to Enhance IL-12 Pro-inflammatory Cytokine Production.ACS Chem Biol. 2022 May 17
