热原与内毒素的分子机理及其在药物生产过程中的作用

热原-从皮下注射用针头说起

注射针头的发明提供了一种新的给药方式，但是早期的药物注射由于种种原因并不安全，经常伴随感染、不良反应、不明原因发烧甚至休克死亡。在19世纪下半叶，人们发现药物注射是导致体温异常升高的原因之一，但是具体机理并不清楚，因此这种“致热因子”导致的疾病被描述为“注射热”。
 

如今，大家对致热原的来源、分子机理越来越清晰，控制和检测越来越常规化，注射药物也越来越安全。引起恒温动物体温异常升高的致热物质，称为“热原”，从来源看包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等，从成分上看有细菌内毒素、脂质胆酸、CpGDNA、鞭毛蛋白和其他非内毒素热原（NEPs）。

热原与内毒素

致热能力最强的“热原”是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。大肠杆菌、铜绿假单胞菌等死亡或自溶后，游离脂多糖（LPS）可以从细胞表面或从制药用水系统生成的生物膜释放出来，或者从原料进入制药用水或无菌系统。由于这种物质不是细菌分泌到体外的毒素（外毒素，如破伤风毒素），而是不被分泌的“存在于细菌体内的毒素”，所以又被称为内毒素。LPS由三部分组成：类脂A、核心多糖、O-抗原。类脂A部分致热作用最强，在LPS的生理活性表现中被认为起到最重要作用。
 

内毒素LPS分子结构示意图

“严格地讲，不是每一种热原都是具有脂多糖结构，但是所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。在药品生产质量管理控制GMP条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。内毒素只是热原的一种类型。
 

在药物生产过程中，热原可以通过原料、溶剂、容器具带入，制备过程中污染，灭菌不彻底或包装不严也产生热原。因此生产实践中除了原料内毒素控制外，还得在制药用水、生产过程中以及产品放行中广泛进行内毒素监控，以保证用药安全。
 

热原的特点非常明显：耐热，注射剂通常灭菌的条件下，往往不足以破坏热原，一般在250℃加热30分钟以上才能失活；两极性；吸附性；能被强酸、强碱、强氧化剂及超声波破坏等。药品生产中必须两方面进行控制，防止热原污染和污染之后设法除，检测显得尤其重要。
 

内毒素检测基本上只针对注射剂和医疗器械

人类与微生物世界处于一个共存的环境，健康的人也是大量微生物的宿主。但是人类在进化过程中建立了天然防御系统（如皮肤和消化道），可以将微生物及其代谢物（毒素等）限制在可以耐受的范围。但注射给药或医疗器械（如医用输液、输血、注射器、植入器械等）使得热原（如果存在）会绕过正常的身体防御，而直接进入血液循环系统，免疫系统对热原如LPS产生免疫应答，信号通路触发和级联反应，释放多种具有抗菌抗炎作用的细胞因子和趋化因子，作用于体温调节中枢引起发热，严重时能导致多脏器损伤。细菌内毒素主要针对注射剂，口服制剂和外用药物制剂一般不做内毒素检测。
 

内毒素导致“发热”的分子机理

制药行业内大家通常会把“内毒素”和“热原”通用，用内毒素检测替代热原检测，来监测生物制品的安全性。内毒素对宿主产生的影响是全身性的（如发烧），而不是像大多数外毒素那样严格意义上的神经学影响。内毒素对人的急性毒性相对较低，表现出低阶免疫反应。从热原产生机理角度看，注射时即使是微量的热原同样也会通过一类称为Toll样受体（TLR）的蛋白质，来触发自然免疫系统，导致恒温动物的体温异常升高。
 

那么，热原是如何通过免疫系统进行反应的呢？
 

Toll样受体是跨膜蛋白，在所谓的前哨细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）中占表达丰富，在先天免疫系统的激活中起着至关重要的作用。它们充当模式识别受体，由微生物或病原体相关分子识别触发级联反应。
 

迄今为止，已发现13种TLR家族蛋白，每种受体都充当一种或几种特定配体的受体，作为对潜在有害微生物或其他外源剂的第一反应的基础。例如，当细胞外TLR4识别大肠杆菌LPS的脂质A组分，并与其他反应协作，导致免疫细胞释放热原性细胞因子。其中两种热原细胞因子，即IL-1和IL-6，会刺激下丘脑，导致前列腺素E2的分泌，引起脑膜炎。其他LPS和NEPs也会与不同类TLR结合，触发免疫系统级联反应，产生发热反应。这种反应是身体抵抗有害病原体能力的方式，然而，内毒素导致的发热却可能致命。热原在体外对巨噬细胞以外的多种细胞也有直接作用。这些影响可能包括有丝分裂、抑制有丝分裂、诱导形态学改变和细胞毒性。
 

不同的热原因子与TLR特异性结合方式