总抗氧化能力(DPPH 法)试剂盒
总抗氧化能力(DPPH 法)试剂盒说明书
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
研究意义：微量法100T/96S
测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。
测定原理：
DPPH·为稳定的自由基 ，溶于甲醇，乙醇等极性溶剂中，在 515nm 处有最大吸收。向DPPH·溶液中加入抗氧化剂时，会发生脱色反应，因此可用吸光度的变化并以 Trolox 作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。
自备实验用品：
恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 120mL×1 瓶，使用前预冷。试剂一：液体 45mL×1 瓶，避光保存。
样品的制备：
(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品
血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用 EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 离心
10min，取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过
30 d）后再测定。
(2) 组织样品
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL
提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
(3) 细胞样品
按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入
1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g，
4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
操作步骤：
1、 酶标仪预热 30min，调节波长至 515nm。
2、操作表（在 EP 管中反应）
注意：空白管只需测定一次，若A 测定小于 0.2，需用提取液稀释后检测。
测定原理：
DPPH·为稳定的自由基 ，溶于甲醇，乙醇等极性溶剂中，在 515nm 处有最大吸收。向DPPH·溶液中加入抗氧化剂时，会发生脱色反应，因此可用吸光度的变化并以 Trolox 作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。
自备实验用品：
恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 120mL×1 瓶，使用前预冷。试剂一：液体 45mL×1 瓶，避光保存。
样品的制备：
(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品
血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用 EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 离心
10min，取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过
30 d）后再测定。
(2) 组织样品
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL
提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
(3) 细胞样品
按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入
1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g，
4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
操作步骤：
1、 酶标仪预热 30min，调节波长至 515nm。
2、操作表（在 EP 管中反应）
| 空白管 | 测定管 | |
| 提取液（μL） | 20 | |
| 样品（μL） | 20 | |
| 试剂一（μL） | 380 | 380 |
| 充分混匀，室温避光反应 20min，取 200μL 至 96 孔板测定 515nm 吸光值，△A= A 空白-A 测定 | ||
总抗氧化能力计算公式：
1、以自由基清除率表示：
DPPH 自由基清除率（％）=（A 空白-A 测定）÷A 空白×100％
2、以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量表示：
标准曲线：y = 0.7072x - 0.0081 R2 = 0.9977 x:Trolox 浓度(μmol/mL) y:吸光值差值△A
单位定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox 的量来表示样本的DPPH 自由基清除能力。
（1） 按样本质量计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/g 鲜重）=（△A+0.0081）÷0.7072×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=1.414×（△A+0.0081）÷W
（2） 按样本蛋白浓度计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/mg prot）=（△A+0.0081）÷0.7072×V 样÷(V 样÷V 样总×Cpr)=1.414×（△A+0.0081）÷Cpr
(3) 按细胞计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/104cell）=（△A+0.0081）÷0.7072×V 样÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））= 1.414×（△A+0.0081）÷ 细胞数量（万个）
（3） 按液体体积计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/mL）=（△A+0.0081）÷0.7072=1.414×（△A+0.0081）
V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 样：反应中样品体积，20μL；W：样品质量，g；Cpr： 样本蛋白浓度，mg/mL
注意事项：
1. 尽量避免使用在酸性条件下呈红色或接近红色的试剂，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
2. 样品中不宜添加Tween、Triton 和 NP-40 等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。
3. 若液体样本为碱性，需要用提取液稀释至酸性后再检测。
