乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）试剂盒使用说明书

乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
 
注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.15）是植物光呼吸代谢中的关键酶，也是光下合成草酸的关键酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。

测定原理：
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿。

试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体35mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加10mL双蒸水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g， 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定操作表：
 

	测定管
样本（μL）	50
试剂一（μL）	650
试剂二（μL）	200
试剂三（μL）	100
充分混匀，立即于1mL石英比色皿中测定324nm处10s和190s吸光值A1和A2，△A=A2- A1

酶活性计算公式：
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr
 
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性（nmol/min /g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 392×△A÷W
ε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min
 
注意事项：

• 测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
• 色素含量较高的样品，可在提取酶时加活性炭吸附。