Evosep One研究进展：SPIN-通过蛋白质组学研究物种

1. 样品制备和数据采集

Fig.1样品制备和数据采集
 

为了提高吞吐量，作者开发了一种新的样品制备方案，该方案由几个手动步骤组成，便于放大（图1）。作者比较了几种不同的提取缓冲液成分，最后选择了盐酸和非离子洗涤剂NP-40的混合物，将脱盐和蛋白质提取结合起来。蛋白质是通过同时脱矿和萃取从骨屑或骨粉中获得的，蛋白质聚集清除磁性小球处理机器人可以自动捕获和消化。肽通过串联质谱快速分离和分析，每天的吞吐量为100个样本(DDA)或每天200个样本（DIA）。

2. 肽快速识别

Fig.2比较通过常规数据库搜索分析的快速100 spd DDA方法和通过基于库与无库方法分析的快速200 spd DIA方法在保留时间内累积的前体识别。

SPIN使用非常短的在线LC梯度来加速纳米流色谱与Orbitrap串联质谱联用。与诊断血浆蛋白质组学中最快的采集方法（每天测量约50个样本）或传统蛋白质组学中每天不到10个样本的常用方法相比，我们通过数据独立采集（DIA）和数据依赖采集（DDA）实现了足够的蛋白质组覆盖率，每天可识别多达200个样本和100个样本。在现代牛骨样本中，快速扫描DDA在11分钟内识别出约1200个前体，而当direct DIA在没有光谱库的情况下进行分析时，DIA在5.6分钟内达到相同的识别数量（图2c）。通过对高pH值反相色谱离线分离的多肽进行DDA分析，每个物种需要一次性生成一个专用的光谱库，而DIA分析鉴定出的前体数量几乎是后者的两倍然而，DIA产生了更多的冗余和重叠前体，因此没有产生两倍的绝对序列覆盖(图2d)。在40个现代参考样本中，DDA方法的平均覆盖率为3678个氨基酸，因此优于无库directDIA方法的3226个氨基酸。以文库为基础的DIA的平均覆盖率最高，为4480个氨基酸。

3. 用已知物种的骨骼验证SPIN

Fig. 3 参考物种分析

作者利用一组来自13个物种的49块已知参考骨对不同数据采集和解释策略的性能进行了优化和评估(图3a)。使用基于库的DIA将所有样本放入正确的属中，而无库的directDIA不能排除黑猩猩是人类，而DDA不能排除8只绵羊样本中的一只是山羊。当涉及到科内分类单元的位置时，这三种方法都表现得同样好。在牛的内部，家养牛(牛牛)可以区别于欧洲野牛(野牛bonasus)，但不能区别于原牛(Bos primigenius)。欧洲野牛本身无法与美洲野牛和牦牛区别开来，在一个案例中，还与瘤牛区别开来。在马类中，驯养的马(马科动物caballus)成功地与驴子(马科动物africanus asinus)区分开来，这是PMF无法做到的，但与蒙古野马(马科动物przewalskii)区分不出来。因此，SPIN在技术上能够进行混合检测，但需要对其可靠性进行评估。

4. 性能和再现性基准

Fig. 4 斯堪的纳维亚铁器时代骨骼的物种鉴定

作者利用文库DIA和精细分组的SPIN分析得到了49个准确的物种鉴定和3个近似的物种鉴定，而11个样品由于肽强度低而被排除（图4B）。副本分析的比较显示，站点覆盖范围为3000个氨基酸的副本之间具有完美的重现性(图4c)。在两个重复的99个样品中，96个样品的文库DIA的SPIN分析与形态学分析一致。作者比较了library DIA、directDIA和DDA三种不同类型肽的鉴定性能，它们对参考样品的鉴定效果非常相似。在Salpetermosen样本集中，差异变得更加明显。伪roc曲线分析表明，基于dia的方法优于DDA，特别是在低重复量的情况下，表明基于dia的测量具有更高的灵敏度(图4d)。在两种DIA方法之间，基于库的DIA比directDIA一致产生更多的真实物种识别。

研究结论：
作者提出了一种新的遗传物种鉴定工作流程，该流程可以弥补高通量靶向方法(如PMF、PCR或ELISA)和更强大的低通量方法(如NGS或传统的LC-MS/MS蛋白质组学分析)之间的差距。我们证明，基于PAC的自动化样品制备工作流可通过LC-MS/MS产生用于骨蛋白质组分析的高质量肽样品，并允许轻松放大。在速度和成本方面，数据采集曾经是一个瓶颈，但现在却大大缩短了，每台MS仪器每天最多可以采集200个样品。用于SPIN的数据解释策略有助于对目前多达156种物种进行无偏比较，并由于FDR在肽和物种识别水平上的控制，提供了较高的可信度。基于对丹麦64块部分降解骨骼的分析，我们得出结论，基于库的DIA方法可以实现最高的置信度和灵敏度。
到目前为止，SPIN数据分析仅限于156个改进文库- dia分析的13个光谱文库。我们设想，随着更多的研究小组共享他们的蛋白质序列数据库和光谱库，这些数字将会增长。此外，随着时间的推移，SPIN工作流本身很可能会得到改进和扩展。我们认为这是一个模块化的协议,它可以作为“分拆”的基础与自定义构建块方法,如:(i)样品制备改性支持从深加工的食品中提取蛋白质,(2)数据采集用于不同的乐器,或(3)数据解释包括性识别。我们已经接触了SPIN的更高级的用例，比如杂交物种的识别，比如骡子。此外，它可以适应，从多个分类群溶解蛋白质混合物或量化蛋白质损伤，在未来。最后，由于每个样品的分析成本的降低和高度的自动化程度，我们预计SPIN工作流程将使LCMS/MS对每个人更容易访问。
 
参考文献：
Rüther, P. L., Husic, I. M., Bangsgaard, P., Gregersen, K. M., Pantmann, P., Carvalho, M., ... & Olsen, J. V. (2021). SPIN-Species by Proteome INvestigation. BioRxiv.