如何有效分析神经细胞表型：亮点应用与高分文献分享

过去几十年，神经科学研究取得有目共睹的发展。尽管如此，了解人脑和神经系统作用，发现致病机理，开发新型、有效的治疗药物仍然非常具有挑战。
 
干细胞技术的最新进展为神经科学研究提供了有效替代途径,，利用人类诱导多能干细胞（iPSCs）来分化创造神经元及星形胶质细胞、小胶质细胞等支持细胞，为建立具有人源化和患者特异性的高级细胞模型提供更大可能。iPSCs模型需要大量的工作优化重编程和分化方法，还需构建可靠的细胞生物学分析方法对模型的病理生理学特征和代表性进行验证。
 
  使用活细胞成像技术对体外疾病模型进行表型分析是一种有效的手段，能够长期鉴定神经细胞的功能。活细胞成像技术能够连续地采集细胞图像，并通过对整个实验流程进行监测（从细胞制备、分化、编辑到动力学分析），提供全面的分析数据。鉴于神经细胞的特点，在培养箱中直接进行活细胞成像分析的方法（如Incucyte® 实时活细胞成像）可以避免环境因素对神经细胞的影响，确保数据的连续性和准确性。通过结合自动化延时成像和实时定量分析的特点，提供可视化的细胞形态、运动等表型分析结果。  近年来，Incucyte® 实时活细胞分析系统被广泛应用于神经科研中，小赛总结了以下四个领域的应用和高分文献与大家分享：
    神经退行性疾病（ND），如阿尔茨海默病(AD)或帕金森病(PD)，是一种引起记忆丧失、运动障碍等失调反应的慢性病。很多ND的特征表现为大脑中蛋白质的异常形成和聚集，逐步引起神经元的退化或死亡。

改进的体外细胞模型更好地反映了疾病的慢性本质，利用活细胞实时成像技术对原代细胞或iPSCs等先进的细胞模型进行分析，为ND的发病机理研究及有效治疗药物的开发提供了更大的便利和可能性。
 

1. 研究药物诱导引发的效应：使用非干扰试剂实时研究疾病相关的神经毒性（图1）
2. 洞察细胞健康和形态：实时获得全方位动态数据（图2，3）
3. 深入了解ND发病机理：评估神经退行性疾病模型中神经元的活动（图4）
4. 可用于2D和3D模型：兼容iPSCs、原代细胞，适用于单培养和共培养（图5）

 

图1. 体外慢性病模型反映Tau蛋白聚集诱导神经突长度变化

图2. 在PD动力学模型中，Oxidopamine (6-OHDA)治疗增加细胞死亡并减少神经突生长

图3. PD模型中的脑区域特异性：与皮层区域相比，6-OHDA选择性地影响黑质和纹状体神经突的生长

图4. 功能评估显示Tau蛋白导致神经元活动减少

图5. 患者来源的AD iPSC模型：2D和3D显示不同的神经突发育和球状形成
 

1. DDX3X acts as a live-or-die checkpoint in stressed cells by regulating NLRP3 inflammasome. Nature, 2019, 573(7775): 590-594.
2. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell, 2019, 179(6): 1289-1305. e21.
3. Regulation of the RNAPII pool is integral to the DNA damage response. Cell, 2020, 180(6): 1245-1261. e21.
4. Target-based discovery of an inhibitor of the regulatory phosphatase PPP1R15B. Cell, 2018, 174(5): 1216-1228. e19.
5. CD22 blockade restores homeostatic microglial phagocytosis in ageing brains[J]. Nature, 2019, 568(7751): 187-192.

  神经肿瘤涉及神经系统癌症（包括脑和脊髓）。脑肿瘤侵略性很强且危及生命，为寻找有效的治疗方法带来了很多挑战。肿瘤的准确定位关乎有效治疗药物的传递。高细胞异质性，神经细胞的有限再生能力，耐药性以及脱靶神经毒性都会影响治疗效果。

有效可靠的体外转化模型有利于我们更深入地了解脑肿瘤的发病过程，从而开发新的有效治疗方法进行干预。实时活细胞分析技术能够借助2D和3D模型对脑肿瘤细胞的健康及形态进行长期、持续性监测。
 

1. 细胞健康的量化及可视化：在培养箱中实时、自动化检测细胞凋亡（图1）
2. 实体脑肿瘤模型建立：通过免标记技术量化细胞增长及细胞活性，研究三维肿瘤球形态（图2，3）
3. 药理学研究：使用非干扰试剂和动力学检测来研究药物诱导的治疗效果（图4）
4. 获得新见解：监测96孔板以深入了解脑肿瘤侵袭潜能（图5）

 

图1. mTOR抑制剂PP242对 SH-SY5Y神经母细胞瘤模型中细胞健康的影响

图2. 实体脑肿瘤3D球模型在生长速度及形态的变化

图3. 人胶质母细胞瘤U87 3D球模型

图4. 不同化疗药物的细胞抑制和细胞毒性作用

图5. 胶质母细胞瘤球状模型侵袭的高通量分析
 

1. Coordinated Splicing of Regulatory Detained Introns within Oncogenic Transcripts Creates an Exploitable Vulnerability in Malignant Glioma. Cancer Cell 32(4):411-426.e11, 2017
2. Fate mapping of human glioblastoma reveals an invariant stem cell hierarchy. Nature, 549(7671):227-232, 2017
3. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nat Med 24, 1204–1215 (2018).
4. Selective BCL-XL inhibition promotes apoptosis in combination with MLN8237 in medulloblastoma and pediatric glioblastoma cells. Neuro-Oncology, 20( 2), 203–2018

  神经突的生长、成熟以及对神经突网络的阻断是研究神经疾病病理学、神经元损伤和再生以及筛选神经毒性的关键。此外，细胞活性也是衡量侯选药物、培养基条件以及环境因素对神经元健康和功能影响的重要指标。检测神经细胞健康可以帮助我们筛选出对神经有保护作用且不会引起神经毒性的候选药物和治疗方法。

Incucyte® 实时活细胞分析系统能够在长时间范围内持续、自动化地对神经元健康和形态的微妙变化进行捕捉和量化。兼容96孔板或384孔板，同时提供高分辨自动化集成软件和专门设计的细胞无干扰试剂，为细胞健康分析提供整体解决方案。
 

1. 动态分析：连续对每个细胞进行实时动态分析，获得比终点法分析更多的数据（图1）；
2. 保护并节约宝贵细胞样品：使用无标记分析和专为神经细胞研究而设计的非干扰荧光试剂，减少光毒性并保活脆弱的神经突（图2，3，4）；
3. 根据您的体外模型灵活选择检测模式：兼容iPSCs或原代细胞，适用于单培养和共培养（图5）；
4. 更快地获得结果：高通量、可重复的数据，可对不同通量的孔板进行快速药理分析（图6）；

 

图1. 获得有价值的ND体外模型生理学相关信息

图2. 在96和384孔板中对神经突长度、分支点和胞体进行免标记、自动化分析

图3. 使用非干扰荧光试剂对共培养的神经突进行动态、长时间的数据采集

图4. 连续不间断地监测浓度依赖性对细胞活性的影响

图5. 在原代细胞或iPSC模型来源的神经细胞中检测神经退行性疾病数据

图6. 消耗微量细胞同时检测6块96孔板或384孔板，自动生成一致性、大容量的数据集合
 

1. Imprinted Maternally Expressed microRNAs Antagonize Paternally Driven Gene Programs in Neurons. Mol. Cell, 2020
2. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron, 107(3), 436-453. 2020
3. Transcriptional programming of human mechanosensory neuron subtypes from pluripotent stem cells. Cell reports, 30(3), 932-946. 2020
4. Stem cell-derived neurons reflect features of protein networks, neuropathology, and cognitive outcome of their aged human donors. Neuron.2021

  神经免疫学主要研究神经和免疫系统在发育过程、稳态以及应对损伤和感染时的相互作用。免疫细胞在神经网络的调节中发挥关键作用，比如小胶质细胞的突触修剪是神经可塑性的关键部分。损伤、感染或稳态丧失可导致神经炎症或小胶质细胞的激活，进而引发吞噬死亡或神经元和感染源死亡。慢性神经炎症被认为是许多神经退行性疾病的根源，小胶质细胞的长期激活对神经系统有害。

Incucyte® 实时活细胞分析系统能够对小胶质细胞进行全面的形态和功能表征。完全自动化的图像采集有助于获取可视化的数据来分析凋亡神经元的小胶质细胞胞葬作用以及生物颗粒吞噬。通过活细胞趋化迁移和侵袭实验量化小胶质细胞在趋化因子作用下的迁移。
 

1. 观察及验证小胶质细胞吞噬作用（图1）
2. 实时定量分析小胶质细胞吞噬作用及胞葬作用（图2，3）
3. 评价小胶质细胞趋化作用（图4）
4. 监测细胞分化和激活后的形态变化（图5）

 

图1. 观察及验证小胶质细胞吞噬作用

图2. 小胶质细胞吞噬作用的实时定量分析

图3. 小胶质细胞吞噬调节机制的评估

图4. 评估小胶质细胞趋向性迁移

图5. iPSC来源的单核细胞（Axol BioScience）分化为小胶质细胞的形态学变化
 

1. Methotrexate chemotherapy induces persistent tri-glial dysregulation that underlies chemotherapy-related cognitive impairment. Cell, 2019, 176(1-2): 43-55. e13.
2. RIPK3 restricts viral pathogenesis via cell death-independent neuroinflammation. Cell, 2017, 169(2): 301-313. e11.
3. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.
4. CD22 blockade restores homeostatic microglial phagocytosis in ageing brains. Nature, 2019, 568(7751): 187-192.
5. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature, 2018, 562(7728): 578-582.
6. Tissue-resident macrophages provide a pro-tumorigenic niche to early NSCLC cells. Nature, 2021: 1-7.