探讨荧光探针化学性质

荧光探针（fluorescence probe）在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。作用用途：荧光免疫法中标记抗原或抗体等。

化学性质：
荧光定量PCR所使用的荧光化学制剂可分为两种:荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

实时荧光PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则：

1. 靶基因的确定:选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性(漏检)。

2. 检测片段的确定:选择检测组内的保守 (突变少)(避免假阴性)、组间特异的序列 (突变多)(避免假阳性)作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

3. 引物:长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃;避免稳定的引物二聚体(特别是多联检测)及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m);序列不能出现连续的G，3'端避免G或C，最后5个碱基内避免两个以上的G或C。

4. 探针:长度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值为68-70℃;避免稳定的二聚体及发夹结构 (自由能大于-3.5kc/m);5'端不能是G;位置尽量靠近上游引物;选择波长差异较大(多联检测)或Fam(单联检测)的荧光标记。