CRISPR-Cas9技术在实现内源性基因替换治疗β-地贫小鼠模型上的应用
2020年，CRISPR/Cas9技术成功摘下诺奖桂冠，成为当下最热门的基因编辑技术。CRISPR/Cas9在医学领域具有强大的潜力，已经在多种基因疾病上显示出强大的治疗效果。
2021年3月，Integrated DNA Technologies(埃德特生物，以下简称IDT)联合美国斯坦福大学、贝勒医学院等全球知名机构的研究人员在国际顶级学术期刊Nature Medicine（影响因子：36.130）发表重磅研究论文，利用IDT公司的Alt-R® CRISPR/Cas9 基因编辑系统和Lonza的电转染系统，成功在小鼠模型中实现用β-珠蛋白替代α-珠蛋白来治疗β-地中海贫血。
在这项研究中，研究人员使用LONZA 4D-Nucleofector对β-地贫来源CD34+ HSPC进行电穿孔，然后利用AAV6作为载体将IDT公司的Cas9结合化学合成的sgRNA递送至HSPC进行基因编辑，在保持高度同源HBA2基因的同时，将内源性HBA1基因敲除并替换成全长HBB基因。
研究结果显示：该基因编辑策略使得β-球蛋白：α-球蛋白信使RNA和蛋白质比率正常化，能够产生功能性的成年血红蛋白四聚体；在小鼠模型体内回输后，经过基因编辑的HSPC能够在小鼠中进行长期和双系造血重建。提示HBB替代HBA1可以作为治疗β-地中海贫血的新型治疗策略。
研究人员表示，这项研究可能是首次证明在Cas9介导的DNA双链断裂（DSB）下，能够实现整个内源性基因替换。该发现有望能够拓展CRISPR/Cas9的应用范畴，以治疗更多基因突变导致的疾病类型。
突破传统CRISPR/Cas9的局限性
近年来，CRISPR基因编辑技术已经广泛应用于许多领域，可以预见的是基于CRISPR的基因组编辑技术转化为医学应用会对人类健康产生重大影响，而此技术也引领了分子生物学工具的一场革命。
但是CRISPR/Cas9目前仍然存在一些局限性，限制了CRISPR/Cas9的快速发展，例如脱靶效应。同时，传统CRISPR/Cas技术在基因切割上具有强大的优势，但是在长片段DNA精确的靶向插入/替换上依然存在一定的挑战。
为了克服这些问题，IDT公司开发了Alt-R® CRISPR/Cas9基因编辑系统，在降低整体脱靶率的同时实现在目标靶点的高效切割。同时在最新发表的研究中，显示出这种新型的CRISPR/Cas9系统能够将长片段的功能性基因插入/替换致病性基因。
Alt-R® CRISPR/Cas9编辑系统主要采用递送核糖蛋白复合物(Ribonucleoprotein complex，RNP)的方法，RNP即Cas9蛋白和gRNA结合形成的具有编辑功能的复合物。与传统CRISPR/Cas9不同的是，在IDT公司Alt-R®CRISPR 系统中，gRNA的组成成分crRNA和tracrRNA均经过优化。
事实上，在2018年发表于期刊Nature Medicine上的另一篇研究文献中，证实了Alt-R® CRISPR/Cas9的优越性能。在该研究中，IDT公司的 Alt-R® S.P. HiFi Cas9呈现出稳定的中靶编辑活性，脱靶率极低。
研究显示：HiFi Cas9/AAV6能够在5个治疗位点（HBB、IL2RG、CCR5、HEXB、TRAC）诱导强大的基因编辑，具有高靶向性；同时HiFi Cas9/AAV6介导镰状细胞疾病（SCD）患者HSPC中p.E6V突变的高水平校正。
通过化学合成的高度定制化的引导RNA（gRNA）序列，配套使用的电转/敲入增强子，各类对照试剂以及免费使用的序列设计工具，实现了从实验设计到结果分析的全流程覆盖，实现高效精准的基因编辑，让实验不再困难。
Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 是丹纳赫集团（Danaher Corporation，纽约证交所代码：DHR）生命科学平台旗下的一家运营公司。IDT致力于面向生命科学界开发、生产并销售核酸产品，为学术与商业研究、农业、医疗诊断和药物开发等领域提供支持。IDT 开发了多项针对基因组应用的技术，涵盖二代测序、CRISPR基因组编辑、合成生物学、数字PCR以及RNA干扰。通过GMP服务，IDT生产的产品被科学家用于研究多种形式的癌症以及各类遗传性和传染性疾病，为超过130,000名生命科学研究人员提供服务，也是公认的定制核酸生产行业的领导者。
Lonza公司的Nucleofector技术轻松实现CRISPR高效转导
CRISPR技术作为除ZFN和TALEN技术外另一种有效的位点特异性基因组修饰的工具。而如何将CRISPR系统高效的转导到目的细胞中，成了另一个亟待解决的问题。Lonza独有的Nucleofector技术已有20年的历史，自2001年问世以来得到广泛的客户认可，已经被证明可作为基于CRISPR的基因组编辑工具的有效非病毒转染方式。Nucleofector技术使用预优化的电转参数和细胞类型特异性电转液的组合，以使得底物能够直接转染到细胞核中。与传统电转相比，直接转染到细胞核中，与细胞分裂无关，即使在非分裂的原代细胞中也具有较高的转染效率。Nucleofector技术按照模块化将小体积转染及大体积转染，可以实现在小体积到大体积的线性放大，适用于从药物研发阶段到临床阶段的转化。
