云序超微量MeRIP测序技术在m6A甲基化文章发表的应用

​m6A甲基化是近年来一大热门研究方向，种种研究表明m6A修饰在各种真核生物、各类组织细胞中普遍存在，并对多种生物学功能、疾病肿瘤的发生发展具有极大影响。m6A甲基化位点的检测依赖于MeRIP-seq，其中的抗体免疫共沉淀（IP）环节要求样品RNA起始量相较普通转录组测序要高，曾经令许多难以大量获取的组织、细胞或体液样本被拒在m6A研究的大门之外。

云序生物自2018年推出了超微量RNA甲基化测序（超微量MeRIP-seq），对免疫共沉淀和高通量测序步骤进行优化，克服了常规抗体富集至少需要100μg总RNA的难题，实现了仅需500ng总RNA即可IP、建库测序，为微量样本研究m6A等甲基化修饰带来福音。本期我们就为大家解析两篇云序客户近期发表的应用了超微量merip技术测序的m6A表达谱文章。

文章1：高度近视眼晶状体前囊膜的m6A修饰谱
发表日期：2020.10.27

研究单位：天津医科大学眼科医院孙靖教授团队

影响因子：4.251

研究方法：m6A-MeRIP-seq，RNA-seq

样品类型：单纯白内障患者和高度近视的白内障患者晶状体前囊膜

样本数量：3 ：3

RNA量：低至500ng

文章链接：Comprehensive analysis of transcriptome-wide m6A methylome in the anterior capsule of the lens of high myopia patients
文章解析：
1）m6A位点的统计和分布

文章通过m6A-MeRIP-seq，在单纯白内障患者和高度近视的白内障患者晶状体前囊膜中分别检测到13617和8569个m6A位点，发生m6A修饰的基因分别为8196和5896个。文章展示了两组中m6A位点的分布和motif序列，并对具有单个和多个m6A位点的基因进行了统计。
2）m6A修饰基因的功能

为了探究m6A修饰与高度近视的关系，文章对两组间差异基因进行了GO和KEGG分析，发现m6A修饰差异基因多与细胞外基质的结构变化和形成有关。
3) m6A修饰与基因表达联合分析

通过m6A-MeRIP-seq和RNA-seq联合分析，文章展示了m6A修饰水平与基因表达水平间的关系，统计发现表达高的基因分组中，受m6A修饰的基因比例也更高。
4）甲基化相关酶的表达

通过qPCR检测了两组样品中6个甲基化相关酶的表达，发现在高度近视白内障患者中甲基化酶METTL3表达上升，去甲基化酶FTO和 ALKBH5、识别蛋白YTHDF1和YTHDF2表达下降，暗示这些酶可能通过调节m6A修饰在高度近视中发挥影响。 
文章2：老年性白内障晶状体上皮细胞内circRNA的m6A修饰和甲基化酶
发表日期：2020.8.6

研究单位：南通大学附属医院眼科研究所

研究方法：m6A-MeRIP-seq，RNA-seq

样品类型：老年白内障患者（ARC）和正常人的晶状体上皮细胞

样本数目：3:3

RNA量：低至500ng

文章链接：Identification and Characterization of N6 -Methyladenosine CircRNAs and Methyltransferases in the Lens Epithelium Cells From Age-Related Cataract

文章解析：

1）circRNA甲基化位点和表达水平整体统计

文章通过对老年白内障患者和正常人的晶状体上皮细胞进行m6A-MeRIP-seq, 检测到circRNA中患者特有的m6A位点974个，正常人特有的m6A位点1109个，共有的位点2793个。文章展示了m6A修饰区域的motif分析，位点染色体分布，统计了带m6A修饰的circRNA的类型、外显子数目，比较了两组样品间m6A水平和circRNA表达，并针对m6A水平差异的circRNA的功能进行了GO和KEGG分析预测。
2）m6A水平和circRNA表达联合分析

文章结合了RNA-seq，两组学联合分析展示了m6A水平与circRNA表达的关系。通过GO功能分析和统计学分析，进一步挖掘了m6A水平差异的circRNA可能影响ARC的功能机制。

3）m6A相关酶对ARC的影响

通过RNA-seq分析发现疾病组去甲基化酶ALKBH5甲基化酶METTL14差异表达，而FTO、METTL3和WTAP表达无显著差异。通过UVB照射后qPCR和WB验证到ALKBH5表达水平升高，暗示 ALKBH5与疾病组m6A修饰差异有关。



云序生物-RNA修饰优势
国内最早提供10分以上RNA修饰文章发表服务平台
提供多种分子RNA修饰测序服务
云序针对m6A、m5C、m7G、m1A, ac4C等修饰提供merip/acrip测序服务，针对m5C、m7G、2’-O甲基化可以采用化学法实现对RNA修饰位点研究的单碱基分辨。
提供超微量RNA修饰测序服务
低至500ng总RNA即可完成测序
提供RNA修饰系统性测序服务

云序m6A RNA修饰课题技术服务五大模块:

• m6A RNA修饰测序

MeRIP-seq
通过使用m6A抗体富集高甲基化的RNA片段，然后结合高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域

• m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证m6A修饰靶基因表达水平。

• 机制互作研究

RIP-seq/qPCR
筛选或验证m6A修饰直接靶点，研究m6A修饰靶基因的调控机制。
RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。

• RNA修饰上游酶的筛选

RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A甲基化的甲基转移酶。

• 检测整体m6A RNA修饰水平

LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体m6A甲基化水平
周期短、RNA起始量小，低至200ng