云序环状RNA研究策略在环状RNA研究的应用

环状RNA作为新发现的RNA分子，从诞生之日起就是光环加身，屡屡登上Science、Nature、Cell等高分期刊。近期发表的《2019研究前沿》中，“环状RNA作为癌症新的生物标志物”成为生物科学领域6个新兴前沿之一。2019年环状RNA共发表SCI论文885篇，较2018年增长约20%，其中大于10分的文章约60篇，是2018年的3倍左右。2019年关于环状RNA的国自然审批金额高达8000多万，环状RNA的火热仍在持续。
那么如何研究环状RNA呢？云序客户的文章给出了答案。今天小编将近日云序客户新发表的6篇环状RNA进行了分类解析，帮助大家对环状RNA的研究有更清晰的认识！

分类一|环状RNA表达谱

1.脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠肺巨噬细胞环状RNA表达谱

发表期刊：Journal of Cellular and Molecular Medicine

影响因子：4.658
发表时间：2019.10
研究方法：全转录组测序 、qRT-PCR等云序提供
文章链接：Characteristics of circular RNA expression of pulmonary macrophages in mice with sepsis‐induced acute lung injury
环状RNA(circRNAs)是一大类非编码RNA，在多种疾病的病理过程中发挥着重要作用。然而，它们在脓毒症肺损伤后的肺巨噬细胞中的作用尚不清楚。在本研究中，小鼠被分为两组：对照组和盲肠结扎穿孔(CLP)诱导ALI组。在SCLP/CLP后24小时从肺匀浆中分离出巨噬细胞。从巨噬细胞通过全转录组测序鉴定circRNA的变化，在接下来的实验中通过RT-PCR验证。在两组中共检测到4318个circRNA。其中，有11个circRNA与对照组相比显著上调和126个circRNA与对照组相比显著下调(p≤0.05，差异倍数变化≥2)。选取其中前10个的差异表达倍数高的circRNA(fold change >4, P<0.05)采用qRT-PCR进行验证。此外，使用miRNA靶基因预测软件，对所有比较中表达差异最大的环状RNA进行详细注释。通过cytoscape软件预测circRNA-miRNA-mRNA。GO分析表明，上调的circRNAs参与了线粒体分布调控和Notch结合等多种生物学功能，下调的circRNAs主要参与了组蛋白H3K27甲基化等生物学过程。KEGG通路分析显示TGF信号通路与上调的环状RNA相关。本研究为环状RNA在脓毒性肺损伤后肺巨噬细胞分化和极化中的作用提供了一个新的视角。
2.AQPS-/-小鼠原发性干眼疾泪腺中circRNA和mRNA表达谱

发表期刊：Frontiers in Physiology

影响因子：3.367
发表时间：2020.8.3
研究方法：全转录组测序、qRT-PCR等云序提供
文章链接：Expression Profiles of CircRNA and mRNA in Lacrimal Glands of AQP5–/– Mice With Primary Dry Eye
干眼症是目前除屈光不正外最常见的眼病，全球发病率为5-34%。目前治疗干眼症的策略包括使用人工泪液、使用抗炎药物和手术。然而，干眼症的发病率仍在上升，迫切需要确定其发病机制，制定有效的治疗措施。在这项研究中，作者使用表现出干眼特征的水通道蛋白5敲除小鼠并对其进行苏木  精 -伊红染色，以确定这些小鼠泪腺的结构变化。作者发现AQP5 - / -小鼠相比于AQP5+/+小鼠的泪腺表现出异常变化。通过全转录组测序也发现了circRNA的差异表达，并预测了一个与吞噬体相关的circRNA-miRNA-mRNA网络。这些结果表明，AQP5的缺乏可能导致circRNA表达变化，进而导致原发性干眼症的发生。本研究旨在为预防和治疗干眼病提供新的理论基础。

分类二|环状RNA海绵机制

3.circMBOAT2是一种新型肿瘤标记物，在结直肠癌中通过吸附miR-519d-3p调节增值/迁移

发表期刊：Cell Death and Disease

影响因子：6.304
发表时间：2020.8.14
研究方法：全转录组测序、qRT-PCR、RIP、RNA pull down等云序提供
文章链接：Circular noncoding RNA circMBOAT2 is a novel tumor marker and regulates proliferation/migration by sponging miR-519d-3p in colorectal cancer
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，预后较差。然而，其发病机制尚未完全阐明，导致总生存率较差。环状RNA (circRNA)是多年前发现的一类非编码RNA。直到最近，人们才重新评估它们在基因表达调控中的重要作用。研究证实circRNAs在多种恶性肿瘤中具有重要的生物学功能。本研究中鉴定一种来自MBOAT2基因的circRNA，并将其命名为circMBOAT2，该基因已被报道可促进前列腺癌进展。作者发现CircMBOAT2在CRC组织和血清中均高表达，且与肿瘤分期相关。受体工作特征曲线显示circMBOAT2在CRC中可以作为一种新的诊断肿瘤标志物。单因素和多因素分析显示，组织中circMBOAT2水平是CRC的独立预后标志物。进一步的功能研究发现circMBOAT2作为miR-519d-3p的microRNA (miRNA)海绵，能够促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，circMBOAT2通过竞争性结合miR-519d-3p和靶向肌钙蛋白相关蛋白(TROAP)能调节CRC细胞增殖和迁移。这些结果提示circMBOAT2可能是一种新的CRC潜在的分子标志物。
4.对年龄相关性白内障circRNA的分析显示，circZNF292可以通过海绵机制调节miR-23b-3p功能

发表期刊：Aging-us

影响因子：4.831
发表时间：2020.9.10
研究方法：全转录组测序、qRT-PCR、RIP、RNA pull down、双荧光素酶实验等云序提供
文章链接：Profiling of circular RNAs in age-related cataract reveals circZNF292 as an antioxidant by sponging miR-23b-3p
老年性白内障(ARC)是世界范围内造成视力损害和可逆性失明的主要原因之一。越来越多的证据表明circRNAs参与多种眼病的调控过程。然而，circRNA在ARC中的表达谱、调控作用和潜在机制仍不清楚。本文中作者对正常和弧形透镜的晶状体进行了全转录组测序，检测到23787个候选circRNA。其中，有466个circRNAs具有显著差异表达，并且在ARC和糖尿病白内障中，表达下调的circRNAs与表达上调的circRNAs相关性更高。随后的生物信息学分析发现，某些差异表达的circRNA参与了ARC中的氧化应激和凋亡相关信号通路。其中，ARC中circZNF292水平显著降低，而miR-23b-3p水平显著升高。靶区预测和双荧光素酶报告基因检测证实circZNF292作为一种竞争性内源性RNA，通过与miR-23b-3p竞争调节抗氧化基因的表达。本文的研究结果表明，ARC患者晶状体前囊中下调的circZNF292可能通过浸润miR-23b-3p参与抗氧化损伤和晶状体上皮细胞凋亡，为ARC的预防和治疗提供了潜在靶点。

分类三|外泌体+环状RNA研究

5.血清外泌体circRNA的RNA-Seq分析显示Circ-PNN是人类结直肠癌的潜在生物标志物

发表期刊：Frontiers in Oncology

影响因子：4.85
发表时间：2020.6.18
研究方法：全转录组测序、qRT-PCR等云序提供
文章链接：RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer
环状RNA (circRNAs)正在成为非编码RNA领域的主要研究热点。越来越多的证据表明，外泌体circRNA可以作为检测各种癌症的潜在生物标志物。然而，大多数血清外泌体circRNA在结直肠癌(CRC)中的临床重要性却很少被研究。在本研究中，作者研究了血清外泌体circRNA在CRC诊断中的可能临床应用。首先，作者对CRC血清样本和健康对照血清样本进行了全转录组测序分析，鉴定出与CRC相关的环状RNA。测序数据显示，CRC患者中有122个差异表达的circRNA，其中100个表达上调，22个表达下调。然后，通过RT-qPCR筛选出8个表达异常的circRNA进行验证。验证分析显示，CRC患者血清外体circ-PNN (hsa_circ_0101802)水平较健康对照组显著上调。通过ROC分析发现circ-PNN在CRC诊断中具有显著价值。最后，作者构建了基于circ-PNN的网络图，以确定其潜在的miRNA-mRNAs结合。并证实了CRC患者中hsa-miR-6833-3P、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-1301-3P的表达与circ-PNN呈负相关。综上所述，该项结果表明，血清外泌体circ-PNN可能是CRC检测的一种潜在的非侵入性生物标志物，可能在CRC的发病机制中发挥关键作用。
6.在多囊卵巢综合征中，卵泡液中缺失外泌体环状lr可降低miR-1294的功能并抑制通过CYP19A1产生雌二醇

发表期刊：Aging-us

影响因子：4.831
发表时间：2020.7.10
研究方法：全转录组测序、qRT-PCR、双荧光素酶实验等云序提供
文章链接：Depletion of exosomal circLDLR in follicle fluid derepresses miR-1294 function and inhibits estradiol production via CYP19A1 in polycystic ovary syndrome
多囊卵巢综合征(PCOS)是生殖女性常见的内分泌代谢紊乱病症，以多囊卵巢、高雄激素和慢性无排卵为特征。卵泡发育异常被认为是多囊卵巢综合征的共同特征。本研究中鉴定了从PCOS患者滤泡液(FF)中分离的外泌体中circRNA的表达谱，从而研究了作为滤泡微环境中重要介质的外泌体circRNA在PCOS病因学和病理生物学中的分子功能。通过全转录组测序，作者比较了PCOS患者和对照组FF外泌体的circRNA表达谱，发现有16个circRNA表达明显不同。GO和KEGG通路分析表明，它们的来源基因在PCOS相关通路中富集，包括卵巢甾体生成、醛固酮合成和分泌以及Jak-STAT信号通路。在16个差异表达的circRNA中，hsa_circ_0006877 (circLDLR)是由其来源基因LDLR(低密度脂蛋白受体)转录本加工而成，该转录本参与了卵巢的类固醇生成。通过qRT-PCR中进一步验证了PCOS FF外泌体的缺失。cytoscape软件预测了circLDLR-miR-1294-CYP19A1竞争性内源性RNA (ceRNA)网络，并通过荧光素酶检测进行证实。在机制上，KGN细胞中功能性circLDLR的细胞间转移和消退实验表明，在受体细胞中，减少外泌体中的circLDLR可以增加miR-1294的表达，抑制CYP19A1的表达，并降低雌激素(E2)的分泌。该发现揭示了circLDLR的ceRNA网络，并为多囊卵巢综合征中卵泡发育异常提供了新的信息。


云序生物—环状RNA研究优势

云序生物作为国内早期提供环状RNA测序的测序公司，自行建立的环状RNA数据库circDB，借物种覆盖广、数据量大、疾病背景多的特点为客户提供优质的服务。云序积累了超过10000例环状RNA测序的经验，样本覆盖20多个物种以及50多种疾病。云序生物提供系统性环状RNA服务，从筛选（circRNA测序）到验证（qPCR）再到机制研究（RIP、RNA pull-down、ChIP、双荧光素酶实验）以及上游表观调控（m6A甲基化等各类RNA修饰研究），为您全方位的覆盖环状RNA上下游分子机制验证的重要研究环节。除了提供组织和细胞的样本类型测序之外，我们还提供体液、血清血浆、外泌体石蜡样本等特殊样本的测序服务。回首过去，从国内circRNA测序到全转录组测序概念提出，到m6A等RNA甲基化测序平台发现，再到如今的eccDNA测序服务，我们一直在紧跟国际科研热点方向进行测序技术的创新。
云序生物：环状RNA一站式服务相关产品


云序环状RNA课题技术服务四大模块:
一、 环状RNA筛选：
1.1 circRNA测序
1.2 全转录组测序（同时检测circRNA、lncRNA、mRNA）
二、环状RNA验证
2.1 qRT-PCR
对选定目标RNA分子可进行qPCR检测服务，包括引物设计与表达鉴定。
2.2 Sanger测序与RNase R酶耐受实验
对选定的环状RNA分子进行反式剪切位点引物设计，扩增后Sanger测序验证环状；使用RNase R酶处理环状RNA分子，验证环状RNA分子稳定性。
三、 CircRNA功能机制研究
3.1 RIP测序/qPCR
针对目标蛋白抗体把蛋白-RNA复合物沉淀下来，并对复合物上的RNA进行测序或对目标RNA进行qRCR表达分析。
3.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，蛋白质谱检测或WB检测与RNA结合的蛋白。设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，qPCR检测或RNA-seq检测与RNA结合的RNA。
3.3 双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验检测两个基因之间的互作。
3.4 病毒液以及siRNA设计
提供circRNA过表达以及干扰慢病毒，腺病毒以及设计siRNA。
四、CircRNA修饰研究
4.1 m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修饰
针对环状RNA各类修饰进行高通量筛选。
4.2 MeRIP-circRNA-PCR验证
对高通量测序的结果，通过qPCR进行进一步验证。