支原体检测步骤
实验步骤：
a.在检测板中加入50μl的检测样品、阳性对照、阴性对照(如无菌水或PBS、新鲜培养液)。
b.加入50μl的支原体检测试剂A，混匀，20-25℃放置5分钟。然后用多功能酶标仪进行化学发光检测，即读值为A。请根据仪器要求设置相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。
c.加入50μl的支原体检测试剂B，混匀，20-25℃放置10分钟。然后用多功能酶标仪进行化学发光检测，即读值为B。注：请严格按照加入支原体检测试剂B后10分钟进行检测，切勿提前或延后，否则可能会影响比值在临界值附近样品的结果判断。
d.计算比值(Ratio)=读值B/读值A。参考表1，比值大于1.2说明有支原体污染，比值小于0.9表示没有支原体污染，比值在0.9-1.2之间可以将原样品继续培养24-48小时后重新检测。
表1. Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒的结果分析。
备注1：有些样品如添加了特殊药物或使用某些特殊培养液，可能含有抑制或增强反应的成分而导致假阴性或假阳性，此时可以将样品稀释10倍后再进行检测，并进一步根据稀释后测定出来的B/A比值来判定是否有支原体污染。
备注2：本试剂盒可以检测出常见的44种支原体污染(具体见附录)，但是不能具体区分是何种支原体污染。如需鉴定污染支原体种类，请选用支原体PCR检测试剂盒(C0301)。
e.本试剂盒用ThermoFisher的多功能酶标仪Varioskan LUX检测一些常见样品的示例结果请参考表2。阳性对照(Positive Control)为试剂盒中提供的阳性对照，常用溶剂(Common Solvents)为超纯水(Water)和PBS，常用细胞培养液(Common Culture Medium)为RPMI-1640和DMEM，阳性样品(Positive Samples)为支原体污染的HeLa细胞培养上清(其中10倍稀释为按1:9用PBS稀释)，阴性样品(Negative Samples)为无支原体污染的BEAS-2B和293T细胞培养上清。本试剂盒提供的阳性对照，由于反复冻融导致部分失活等因素，实际测定出来的比值可能会和表2和图2中所列数据有较明显的偏差。而超纯水、PBS、RPMI-1640和DMEM检测出来的比值数据和所列数据会相对比较接近。实际测定出来的读值A和B，不同的仪器设备可能会有非常大的差别。
表2. Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒(低灵敏度仪器用)检测数据示例。注：ThermoFisher的多功能酶标仪Varioskan LUX为高灵敏度仪器，所以读值较高，实际在低灵敏度仪器中，读值可能在几十至上千。
图2. Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒(低灵敏度仪器用)检测数据分析。实际读数和比值会因细胞种类、细胞培养液、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
.化学发光仪(luminometer)或者具有检测化学发光功能的酶标仪、和酶标仪配套使用的化学发光检测专用的96孔板(白板)。
b.无菌离心管、枪头及移液枪。
2.试剂和检测样品准备：
a.所有试剂使用前要平衡至室温，最适宜的温度是20-25℃。
b.检测样品准备：取0.2-1ml培养3-6天的细胞上清(培养时间较短的细胞上清也可以检测，但上清中释放的支原体较少，检测灵敏度会显著下降)，200×g (约1500rpm)离心5分钟以沉淀少量漂浮的细胞或细胞碎片，取上清。上清样品最好收集后立即检测，也可以在室温或4℃放置并当天检测，或者置于-80℃保存半年内检测。低温保存的样品检测的时候须室温融化并达到室温后才可用于检测。
a.在检测板中加入50μl的检测样品、阳性对照、阴性对照(如无菌水或PBS、新鲜培养液)。
b.加入50μl的支原体检测试剂A，混匀，20-25℃放置5分钟。然后用多功能酶标仪进行化学发光检测，即读值为A。请根据仪器要求设置相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。
c.加入50μl的支原体检测试剂B，混匀，20-25℃放置10分钟。然后用多功能酶标仪进行化学发光检测，即读值为B。注：请严格按照加入支原体检测试剂B后10分钟进行检测，切勿提前或延后，否则可能会影响比值在临界值附近样品的结果判断。
d.计算比值(Ratio)=读值B/读值A。参考表1，比值大于1.2说明有支原体污染，比值小于0.9表示没有支原体污染，比值在0.9-1.2之间可以将原样品继续培养24-48小时后重新检测。
表1. Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒的结果分析。
| B/A比值 | 结果分析 | 处理方法 |
| <0.9 | 支原体阴性，无支原体污染 | 无需处理，定期检测 |
| 0.9-1.2 | 临界值，结果较可疑 | 样品隔离培养24~48小时后再进行测试 |
| >1.2 | 支原体阳性，有支原体污染 | 细胞灭菌处理后丢弃或隔离后用专用的支原体预防或去除试剂处理 |
备注2：本试剂盒可以检测出常见的44种支原体污染(具体见附录)，但是不能具体区分是何种支原体污染。如需鉴定污染支原体种类，请选用支原体PCR检测试剂盒(C0301)。
e.本试剂盒用ThermoFisher的多功能酶标仪Varioskan LUX检测一些常见样品的示例结果请参考表2。阳性对照(Positive Control)为试剂盒中提供的阳性对照，常用溶剂(Common Solvents)为超纯水(Water)和PBS，常用细胞培养液(Common Culture Medium)为RPMI-1640和DMEM，阳性样品(Positive Samples)为支原体污染的HeLa细胞培养上清(其中10倍稀释为按1:9用PBS稀释)，阴性样品(Negative Samples)为无支原体污染的BEAS-2B和293T细胞培养上清。本试剂盒提供的阳性对照，由于反复冻融导致部分失活等因素，实际测定出来的比值可能会和表2和图2中所列数据有较明显的偏差。而超纯水、PBS、RPMI-1640和DMEM检测出来的比值数据和所列数据会相对比较接近。实际测定出来的读值A和B，不同的仪器设备可能会有非常大的差别。
表2. Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒(低灵敏度仪器用)检测数据示例。注：ThermoFisher的多功能酶标仪Varioskan LUX为高灵敏度仪器，所以读值较高，实际在低灵敏度仪器中，读值可能在几十至上千。
| 样品 | 阳性对照 | 常用溶剂 | 常用细胞培养液 | 阳性样品 | 阴性样品 | ||||
| C0297S-3/C0297M-3 | 超纯水 | PBS | RPMI-1640 | DMEM | HeLa培养上清 | 10倍稀释 | BEAS-2B培养上清 | 293T培养上清 | |
| 读值A | 17975 | 26525 | 23925 | 23990 | 24390 | 36685 | 25550 | 24825 | 24960 |
| 读值B | 197150 | 15865 | 14970 | 15910 | 15630 | 1662000 | 38265 | 16445 | 16760 |
| 比值(B/A) | 10.97 | 0.60 | 0.63 | 0.66 | 0.64 | 4.53 | 1.50 | 0.66 | 0.67 |
图2. Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒(低灵敏度仪器用)检测数据分析。实际读数和比值会因细胞种类、细胞培养液、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。.化学发光仪(luminometer)或者具有检测化学发光功能的酶标仪、和酶标仪配套使用的化学发光检测专用的96孔板(白板)。
b.无菌离心管、枪头及移液枪。
2.试剂和检测样品准备：
a.所有试剂使用前要平衡至室温，最适宜的温度是20-25℃。
b.检测样品准备：取0.2-1ml培养3-6天的细胞上清(培养时间较短的细胞上清也可以检测，但上清中释放的支原体较少，检测灵敏度会显著下降)，200×g (约1500rpm)离心5分钟以沉淀少量漂浮的细胞或细胞碎片，取上清。上清样品最好收集后立即检测，也可以在室温或4℃放置并当天检测，或者置于-80℃保存半年内检测。低温保存的样品检测的时候须室温融化并达到室温后才可用于检测。
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