COVID-19实验室诊断方法选择和新技术展望

COVID-19从2019年末到现在，影响者我们每一个人。我们每一位生物医药人，也都在不同行业为新冠抗疫努力着。


闲谈Immunology新冠相关文章回顾

2013年作者因为工作需要，一直在甲流H7N9防控的第一线，形成一个直觉：流感或其他呼吸道病原体，如果引起呼吸窘迫多与细胞因子风暴相关。
因而于2月5日，在公众号发表：细胞因子风暴综合征临床特点及治疗药物; 有超过1.2万人阅读，之后多个公众号转载，累计超过10万人阅读。


2月12日发表：泛冠状病毒药物开发的基础知识，希望能够给药物研发的科学工作者，从实验动物到策略选择提供一些参考。

2月17日发表：病毒免疫逃逸机制--诱导免疫细胞凋亡、衰老和耗竭，警示小心病毒通过各种机制逃避免疫，和病毒的战斗是一个长期的过程。


之前的人感染冠状病毒，呈季节性流行趋势，多从12月开始，次年4月慢慢结束，对温湿度较为敏感，参考阅读：呼吸道病毒季节性流行的原因与预防

SARS-CoV-2夏季，在我国之外大范围流行，显示这个规律被打破了，专家也提示，我们可能需要长时间关注SARS-CoV-2流行，做好个人防护。


近日作者又着手开始写一些新冠的文章，希望大家一起来关注和回过来思考一些问题：

大范围人群疫苗免疫后，新冠病毒再度流行时，是否会因为ADE而增加感染。8月26日发表：抗体依赖增强作用（ADE）免疫学基础和抗体疫苗开发的提示。


COVID-19实验室诊断

SARS-CoV-2实验室诊断，主要涵盖核酸检测（qPCR，测序，核酸等温扩增），抗原免疫学检测（胶体金法为主），血清抗体免疫学检测（胶体金或ELISA法），细胞因子风暴伴随诊断（ELISA法，或者Luminex多因子检测等）。
 

核酸检测

基因测序

对于任何新发未知传染病，需第一时间分离病毒株，进行基因测序。1. 得到准确的基因序列，是后续qPCR法，抗原抗体研发，和免疫检测研发的基础。2. 从进化树上，追溯其可能来源。3. 明确病人是否多种病原体感染同时并存。
 

但是基因测序，对操作人员和分析人员要求高，时间长，成本高，不适合人群筛查。因而后续多转用PCR法。大型实验室，可以采用定量PCR（qPCR），社区或者野外，可以采用便携式PCR等。

定量RT-PCR（Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）

获得基因序列后，可以在极短的时间内，设计特异性引物，通过qRT-PCR进行检测。通常，也是临床上最早可以获得的，进行大规模人群筛查的方法。

qRT-PCR特点

• 方法灵敏度足够高，可以达到10拷贝/ml 以下（文献1），

• 时间约2-4小时

• 疫情早期诊断主要方法（抗原抗体的开发需要时间）

• 假阴性（CT影像诊断阳性，核酸阴性）可能原因：突变引起的引物脱靶；鼻咽拭子取样问题；样本运输问题等

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）
LAMP作为POCT式的核酸检测设备，在传染病爆发期，可以大大增加检测可及性（尤其是在技术欠发达地区，交通枢纽，机场等），以及检测及时性。

• RT-LAMP的检测灵敏度可以达到10拷贝

• 60-65℃等温扩增

• 时间约15-40分钟

• 仪器价格较qRT-PCR低

CRISPR-Cas RNA鉴定系统

CRISPR-Cas系统是鉴定平台，主要用于鉴定RT-PCR或者RT-LAMP的扩增产物。具体原理和过程见下图。

CRISPR-Cas联合RT-LAMP技术，可以实现LoD：10拷贝/μL ，（90% 灵敏度100% 准确度）

图片来源于文献3

 

免疫学检测

 

获取基因序列之后，大量的上游原料厂商开始表达抗原，研发抗体。随即抗原和抗体检测试剂快速开发。主要的检测方法有ELISA法，胶体金法，化学发光法，免疫荧光法等。其中胶体金法，作为POCT的方法，使用最为广泛。

抗原检测（胶体金法）
国内有多个产品上市，例如：

• 东方基因（Healgen)新型冠状病毒快速检测试纸（胶体金免疫层析法）；

• 万孚生物（wondfo）2019-nCoV新型冠状病毒抗原检测试剂（免疫层析法）；

• 重庆业为基COVID-19新型冠状病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）

特点：

• 快速：全程10-15分钟

• 早期：和核酸一致

• 便利：无需仪器配套

• 灵敏度：5-10 TCID50/test

• 缺点：灵敏度不如核酸qRT-PCR法

• 用途：呼吸道病毒鉴别诊断

抗体检测（胶体金法）
用于回顾性检测，流行病学调查。

因为免疫流程，感染初期并不出现抗体，因而不适合疾病的早期筛查。一般适用于疾病的回顾性检测，流行病学调查。另外，因为疾病消退后，抗原和核酸消失，但是抗体IgM和IgG半衰期长，因而回顾性研究，可以使用抗体血清学检测。

新冠IgM/IgG抗体检测试剂盒，有更多的厂家（万孚，丽珠试剂等）提供，不做赘述。


细胞因子风暴检测
细胞因子风暴是新冠肺炎病情危重的重要因素，因而在新冠肺炎诊疗方案中建议：有条件者可行细胞因子检测。
细胞因子风暴检测组合包含：IL-1β，IL-17A，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，IFN-γ，MCP-1，IP-10，GM-CSF等。

细胞因子本是Roche，西门子等体外诊断巨头已有检测项目，但多年来并不受关注，甚至没有相关组合试剂提供，尤其是可以检测所有项目的组合试剂。
在本次新冠期间，经典的多因子检测品牌Luminex和基于流式细胞术的多因子检测在临床上占据了主导位置。

未来，传统巨头是否会增强其细胞因子检测平台，尤其是试剂提供吗？毕竟，除了新冠，甲流等；CAR-T治疗，免疫检查点治疗副作用检测，细胞因子风暴也是非常重要的项目，是有一定市场体量的。

未来技术展望

新冠防控的薄弱点是人群聚集的公共区域，如菜市场，商城，交通工具等。如何对公共区域进行检测，是一个难点，国内清华伯克利深圳研究院，南方科技大学，联合罗切斯特理工学院的科学家，在ACS  infection disease上的文章，给了很多开创性的思路，如下图，供大家参考。

 

喵评：上述方法，其实大家早已熟知。梳理一遍，主要帮大家了解不同技术的使用和开发背景。如果，有科学家能够开发出公共区域病毒采集检测预警系统，将会极大帮助现在和未来新发传染病的公共预防控制。

 

参考文献

1. Chan, J. F.-W.,, et al. (2020) Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated in Vitro and with Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 58,e00310-20.

2. Robin Augustine, et al, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid, Sensitive, Specific, and Cost-Effective Point-of-Care Test for Coronaviruses in the Context of COVID-19 Pandemic, Biology 2020, 9, 182

3. MEAGAN N. ESBIN et al, Overcoming the bottleneck to widespread testing: a rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection,RNA (2020) 26:771–783

4. D'Cruz RJ, Currier AW, Sampson VB，Laboratory Testing Methods for Novel Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)，Front Cell Dev Biol . 2020 Jun 4;8:468

5. Xi Yuan, Chengming Yang, Qian He, Junhu Chen, Dongmei Yu, Jie Li, Shiyao Zhai, Zhifeng Qin, Ke Du,Zhenhai Chu,and Peiwu Qin，Current and Perspective Diagnostic Techniques for COVID-19，ACS Infect. Dis. 2020, 6, 1998−2016