从表达谱至海绵机制完美进阶，教你轻松玩转环状RNA测序加机制研究！
禽白血病病毒J亚群(ALV-J)属于逆转录病毒属，慢病毒亚科的家族成员，可引起禽类多种肿瘤性疾病，如骨髓细胞瘤、肉瘤、血管瘤、肾肿瘤和成红细胞增多症，以及禽类骨髓白血病，导致受感染鸡的高死亡很率。该分散的ALV-J菌株分布广泛，既能水平传播又能垂直传播，往往造成禽类养殖领域的巨大经济损失。目前我们对ALV-J诱导的肿瘤发生机制仍不清楚，导致根除ALV-J带来的损害仍然是一项重大挑战。
近日，云序客户华南农业大学的谢青梅研究团队利用云序生物提供的环状RNA测序、RIP和RNA pull down等技术手段首次揭示了感染了逆转录病毒ALV-J的家禽鸡显著上调的circ-Vav3通过海绵吸附gga-miR-375的作用来上调靶基因YAP1的表达，从而促进肝肿瘤的发生。该研究成果以“Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition”为题发表在《RNA Biology》（IF: 5.216）。值得注意的是，该研究团队前期已经利用云序生物提供的环状RNA测序服务成功发表了一篇ALV-J病毒抗性与病毒易感的鸡肝脏组织当中环状RNA表达表达谱的文章（Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens），发现了32个差异表达的环状分子，其中12个在ALV-J抗性样本中表达量显著升高，而20个在易感样本中表达量更高，而生信预测表明这些环状RNA分子能够调控免疫分子通路的信息传递从而改变生物体的免疫力。此次又与我司深入合作，利用RIP和RNA pull down技术阐明了其通过海绵吸附的调控作用来促进肝肿瘤的形成。真正实现了从环状RNA表达谱至功能机制研究的完美进阶，为其他物种或疾病类型的研究提供了不错的参考。
该团队先前的研究揭示gga-miR-375在禽类白血病病毒J亚群(ALV-J)感染的鸡肝脏肿瘤中表达显著下调。结合当下的研究热点认为gga-miR-375可能与circRNA有关。在本研究中，环状RNA测序结果显示，在感染ALV-J的鸡肝脏肿瘤中，circ-Vav3显著上调。进一步通过RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH实验证实circ-Vav3是gga-miR-375的海绵。此外，研究者通过双荧光素酶报告基因检测证实YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且进一步验证了circ-Vav3通过海绵吸附作用释放gga-miR-375的靶基因YAP1，进而通过circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴影响上皮间质转化（EMT）过程以促进肿瘤的发生，并在临床样本中得到了验证。
研究内容：
1.circRNA表达谱及其结合位点预测
研究人员以ALV-J感染的鸡肝为测序样本，通过环状RNA测序（由云序生物提供）检测到有2822个circRNAs呈现差异性表达，其中2808个circRNAs显著性上调。并通过聚类图、火山图和散点图对25种表达上调的circRNAs进行生信分析，发现circ-Vav3上调最显著。此外，该团队先前的研究揭示了同样的样本中gga-miR-375下调最明显。接下来利用TargetScan和miRanda软件对25种circRNAs可能结合的miRNAs进行生信预测，结果显示其中circ-Vav3与gga-miR-375结合的评分最高。
2.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375
circ-Vav3的命名主要是基于该环状RNA来源于Vav3基因的8-11号外显子；预测结果显示circ-Vav3与gga-miR-375之间存在完美的靶向位点。利用海绵机制指示蛋白进行AGO2 RIP实验（由云序生物提供），对捕获的AGO2蛋白进行qPCR检测发现circ-Vav3与gga-miR-375显著富集；同时利用circ-Vav3探针进行RNA pull down实验（由云序生物提供）检测出了gga-miR-375的结合情况。RNA-FISH实验证实了circ-Vav3主要存在细胞质，而gga-miR-375即存在于细胞质又存在于细胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通过相互结合发挥调控作用。
3.gga-miR-373 通过与YAP1的3’UTR区结合负调控YAP1的表达，并且过表达gga-miR-375可减弱EMT
生信预测揭示YAP1是gga-miR-375的潜在靶基因，进一步的双荧光素酶报告基因证实了gga-miR-375可通过结合YAP1的3’UTR区抑制YAP1的表达；在体外细胞系DF-1中过表达gga-miR-375可明显下调YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通过直接结合YAP1的3’UTR区，抑制YAP1基因的表达。EMT现象是肿瘤发生转移的前兆，该过程伴随着关键基因的上调（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下调（E-cadherin）。通过过表达gga-miR-375发现可以显著上调EMT正相关的基因的mRNA和蛋白水平，下调负相关基因的mRNA和蛋白水平，并且证明了EMT相关基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通过抑制YAP1基因的表达间接抑制EMT的进程。
4.YAP1过表达促进EMT，使细胞迁移能力增强
研究者进一步通过Transwell实验证明了过表达YAP1可显著增强细胞的迁移能力，同时qPCR和WB也证实在YAP1过表达的DF-1细胞系中，EMT相关的关键基因表达情况发生了明显的改变，说明YAP1可促进EMT的发生和细胞迁移能力。
5.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375上调靶基因YAP1从而促进EMT
经过前期工作的积累，研究人员认为circ-Vav3在胞浆中海绵吸附gga-miR-375，从而上调YAP1和EMT相关基因的表达。共表达实验显示，相对于过表达gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空载组），而过表达gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（实验组）的EMT正相关基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明显上调，而负相关基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明显下调；更加证实了circ-Vav3通过海绵作用吸附gga-miR-375，上调其靶基因YAP1的表达，进而诱导EMT的发生。
6.ALV-J感染细胞系和临床样本的验证
利用ALV-J病毒株感染DF-1细胞系后，利用WB和qPCR技术手段进行检测发现，细胞中circ-Vav3表达显著上调，gga-miR-375表达显著下调；同时，YAP1和EMT正相关基因的蛋白和mRNA水平也显著的上调，相反的，EMT负相关基因的蛋白和mRNA水平则显著下调。从养鸡场获取的感染ALV-J的鸡的肝样本，进行相同的检测，得到了相同的结果，进一步夯实了整个实验的结论。
总结：
“一站到底”！云序生物环状RNA研究从做谱（环状RNA测序、全转录组测序、环状RNA甲基化测序）到机制研究（RNA pull down、RIP），为您全方位的覆盖差异环状RNA分子筛选到下游分子机制验证的重要研究环节。此外，云序生物自行建立并维护的环状RNA数据库circDB凭借物种覆盖广、数据量大、疾病背景多的特点，支持许多客户发表环状RNA成果。在过去的时间里云序生物和各位生命科学领域的专家学者、医护工作者共同进步成长，探索未知的奥秘。回首过去，从表观遗传学到表观转录组学，从基因组到蛋白质组，从细胞内到外泌体，云序生物依托于高通量测序技术为越来越多的临床与基础生物研究者提供了高质量的科研服务。在我们的共同努力下，云序客户发表越来越多的高分文章。
做测序，选云序！
全文链接
https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15476286.2018.1564462?journalCode=krnb20
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