过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒使用说明

过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒

 

分光光度法 50 管/48 样

 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

 

POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

测定原理：

 

POD 催化 H₂O₂ 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。

 

需自备的仪器和用品：

 

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

 

试剂的组成：

 

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

 

试剂二：液体×2 瓶，4℃保存；用时每瓶加入 5mL 试剂一充分溶解；用不完的试剂 4℃保存；试剂三：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

 

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

 

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

 

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤和加样表：

 

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 470nm，蒸馏水调零。

 

2、 测定前将试剂一、二和三在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上。

 

3、 样本测定表

 

试剂名称（µL）	测定管
样本	15
蒸馏水	270
试剂一	520
试剂二	130
试剂三	135

 

在 1mL 玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录 470nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。计算 ΔA＝A2-A1。

注意：

 

1、若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上，测定时加入 15µL 样本和 1055µL 混合液测定。

 

2、如果 ΔA 小于 0.005，可将反应时间延长到 5min。如果 ΔA 大于 0.5，可将样本用提取液

 

稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

 

POD 活性计算：

 

1、血清（浆）POD 活性

 

单位定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。计算公式：

 

POD（U/mL）=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =7133×ΔA

 

2、组织、细菌或细胞 POD 活性

 

(1) 按样本蛋白浓度计算

 

单位定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

 

POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

 

（2）按样本鲜重计算

 

单位定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

 

POD（U/g 鲜重）＝ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

 

（3）按细菌或细胞密度计算

 

单位定义：每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

 

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =14.27×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.07mL； V 样：加入样本体积，0.015mL；V 样总：加入提取

液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。