徕卡显微镜应用：种植体周围炎净化处理对牙种植体钛合金表面粗糙度和化学性质的影响：对骨整合的影响
种植体周围炎净化处理对牙种植体钛合金表面粗糙度和化学性质的影响：对骨整合的影响
Jordi Diaz-Marcos, PhD 1 Joan Vilana Balastegui, MSc 1 Angel F. Espías Gómez, DDS, MS, PhD 2 Luis Alberto Sánchez Soler, Dr. Frédéric Parahy, Dr. 2
1University of Barcelona (UB), 科学技术中心 (CCiTUB), 西拔牙巴塞罗那SPM实验室,
2巴塞罗那大学(UB), Faculty of Dentistry, L'Hospitalet Ll., Spain
2014年2月19日
钛（Ti）合金为生物相容性材料，经常用于人体植入物，尤其是在牙科中。本研究对种植体常用的Ti-6Al-4V（TAV）合金进行不同类型的种植体周围炎（种植体周围牙龈及牙齿组织感染）牙科处理，以探讨合金表面粗糙度和化学性质所受的影响。本研究旨在更好地了解这些常用的牙科处理方法是否有助于提高种植体与骨结合的能力，即愈合过程骨再整合到种植体材料中的能力。研究了各种牙科处理方法（比如超声处理、喷射抛光、激光照明和化学物质处理）对Ti合金表面粗糙度和化学性质的影响。如果运用得当，这些牙科方法或可在成功治疗种植体周围炎后提高Ti合金种植体的骨再整合概率。
前言
背景
Ti合金牙种植体长期的成功应用，在很大程度上取决于快速愈合过程材料与颌骨的安全结合（骨整合）[1]。Ti合金的表面形貌对牙种植体的长期应用的成功性至关重要。过去十年，为了改进骨整合过程，专家们致力于开发Ti种植体材料的处理方法[2]。最近的研究发现，Ti合金种植体的理化改性，导致除骨形成反应受到调节之外，细胞募集、黏附、炎症和骨重建活动也受到显著调节[3]。牙种植体应用总体上取得了很大成功，大约96%留在患者体内10年以上。图1示出牙种植体（带基台和牙冠）置入口腔颌骨的一般过程。
近年来，人们针对种植体周围牙质组织感染（种植体周围炎）提出了若干处理策略（机械、化学、物理化学等）[4]。种植体周围炎是“种植体周围的发炎过程，其特点为软组织发炎和支持骨丢失”[5]。如果愈合过程允许发生骨整合，将人工基台和牙冠安装到牙种植体上，以取代缺失的牙齿。但如果种植体周围牙龈和牙质组织的炎症是由细菌感染引起的，牙种植体将有可能发生骨丢失并发症。有利的牙种植体特性，即氧化钛有助于细胞黏附的高度反应性，因细菌存在及其代谢活性残留而改变。因此，受污染表面相当于异物，会加重种植体周围软组织炎症和骨丧失。种植体周围炎的处理涉及表面去污和清洁。适当使用这些不同的种植体周围炎处理方法，或许可以使Ti合金表面改性，促进宿主对种植体的反应[6]。本报告讨论不同牙科处理方法对Ti合金种植体材料表面特性的影响，以及种植体周围炎愈合过程这些处理方法是否可以加快牙种植体的骨整合。牙种植体骨整合耗时较长（3～6月），因此可以加快这种现象的表面改性将缩短愈合时间，降低失效率，并将患者的不适感降至最低程度[7]。
A B
C D
|
|
图1A–D：钛（Ti）合金牙种植体置入颌骨示意图：A）置入颌骨的典型Ti种植体；B）与骨结合的种植体（带支撑牙冠的固定基台；C）和D）种植体示例，带有基台和取替缺失牙齿的粘结牙桥。
表面粗糙度的影响
改进钛种植体表面形貌，可以增强骨与种植体的接触以及改进界面的力学性能[8–11]。在缺乏对照比较临床试验的情况下，累积的实验证据支持使用表面形貌得到改进的钛种植体[12]。
表面粗糙度已被确定为一个重要的参数，该参数与种植体材料锚定到骨组织的能力相关[13]。增大种植体材料表面粗糙度的方法多种多样，最常用的是：加工、喷砂、酸蚀、阳极氧化、激光改性，或上述技术的组合。此外，已根据其表面粗糙度平均值（Sa），即表面的平均峰高和平均谷深，将市售种植体分为四类：光滑（Sa < 0.5μm）、轻微粗糙（0.5μm < Sa < 1.0μm）、中度粗糙（1.0μm < Sa < 2.0μm）和粗糙（Sa > 2.0μm）[14]。另一个重要的参数是Sdar，它表示粗糙表面参照完全平坦光滑的表面展开后的面积。根据Teughels等[15]，种植体表面粗糙度及其化学成分对菌斑结构数量和质量具有显著的影响。最后，目前没有证据表明暴露于口腔的种植体表面将形成其成分取决于表面粗糙度的生物膜 [16–17]。种植体形貌如何表示和分类？Wennerberg简要回顾了适用于牙种植体的形貌测量方法。为了解释平均平面形貌要素的各向同性偏差，必须进行三维（3D）测量[18]。接触式仪器，比如表面轮廓仪，会低估表面形貌尺寸。以钛合金等软材料制成的螺旋状种植体，其评估首选光学仪器[19]。2D表面测量和表征的局限性，推动了高效实用的3D表面测量和表征技术的开发。借助三维技术可以更好地了解表面的功能状态。
实验方法
钛合金改性工艺
总共分析了25件圆柱形种植体（每种样品5件，对照样品+4种处理工艺），种植体原料为5号商业纯（CP）钛（Ti）合金（PM国际供应商，LLC，EEUU），即Ti-6Al-4V（TAV），其成分为90% Ti、6% Al（铝）和4% V（钒）。样品直径10mm、长5mm。以几种不同的牙科常用方法处理种植体样品的表面：
- 化学方法：接触四环素和光敏剂；
- 物理方法：超声处理
- 物理化学方法：碳酸氢盐喷射抛光；
下文将予以详述。
显微技术
使用下列显微技术：
- 共聚焦显微镜（CM）：CM提供一种获取物体3D图像的便利手段。用Leica DCM 3D双系统测量表面形貌和计算表面粗糙度参数。以放大率为20x、数值孔径（NA）为0.50的共聚焦物镜获取图像。
- 原子力显微镜（AFM）：在室温下用配备Nanoscope IVa控制器（Bruker）的Dimension 3100 AFM镜头进行AFM研究。所有AFM图像均用矩形硅悬臂（标称顶端针尖半径为10nm、弹簧常数为15 N/m、共振频率为145kHz）以敲击模式记录，扫描速率为1Hz，每张图像512×512个数据点。
- 扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线谱（EDS）：用JSM-7100F SEM（JEOL）和INCA 250 EDS（Oxford Instruments）研究Ti合金的表面形貌和组成。操作条件如下：加速电压15kV、放大率200x、工作距离10mm。
用于处理种植体的牙科处理方法
探讨以下典型牙科处理方法对Ti合金表面粗糙度和化学性质的影响：
- 碳酸氢盐喷射抛光
碳酸氢盐细粉末（平均粒径约150μm）喷射可以快速有效地清洁牙齿（Turbodent by Mectron）。碳酸氢钠颗粒与热水混合，然后加速，直至获得极细而且规则的射流。以生理盐水为冲洗剂，对Ti合金种植体样品进行喷射抛光处理1分钟，然后用大量生理盐水冲洗。 - 四环素
盐酸四环素（Sigma-Aldrich）是一种抗生素，主要用作抑菌剂，但在特定浓度条件下可以用作杀菌剂。盐酸四环素的粉末形式具有很强的腐蚀性，可用于种植体表面消毒。在本研究中，Ti合金接触四环素/生理盐水溶液（四环素浓度= 50mg/ml）1分钟，然后用大量干净的生理盐水冲洗。 - 超声波
超声波清洗是现代牙科常用的技术。它用于牙齿周围和种植体周围处理。超声波尖头用非常薄的硬化钢制作（Sirosonic by Sirona）。振动诱导一种称之为空腔化的现象，即在含有气体或蒸气的液体介质中形成空腔或气泡。此外，振动有助于清除伤口腐肉，即分解附着于牙齿或种植体表面的微生物。以生理盐水为冲洗剂，超声处理Ti合金种植体样品1分钟（30kHz）。 - 光动力学疗法
光动力学疗法（PDT）需要使用光激活染料（光敏剂）。当光敏剂在有氧条件下被激活时，会产生具有细胞毒性的物质，这些物质可以有效地抗病毒、细菌和真菌，因此PDT可用于局部感染治疗。牙科光动力学疗法涉及光敏胶的使用。本研究使用甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich），它被波长为570nm的光激活。光敏胶产生的氧自由基与微生物细胞壁强烈反应，因此对后者有毒性作用。该疗法通常用于种植体周围炎治疗。在本研究中，Ti合金种植体样品以甲苯胺蓝凝胶覆盖，接着照射（FotoSan灯，570nm），静置1分钟（100µg/mL），然后再次照射（软激光，906nm），最后用大量生理盐水冲洗。
粗糙度分析
以共聚焦3D光学表面测量系统（Leica DCM 3D）测量表面粗糙度，使用蓝光照明以获得较高的分辨率。获得了每一个处理过程五种不同Ti合金种植体样品的各种表面粗糙度参数（表1）。
|
符号 |
单位 |
参数 |
3D参考 |
|
振幅参数 | |||
|
Sa |
μm |
高度算术平均值 |
ISO/DIS 25178-2 ASME B46.1 |
|
Sq |
μm |
高度均方根（rms） | |
|
其他3D参数 | |||
|
Sdar |
% |
展开面积与投影面积的比率 |
|
表1：本研究分析的3D粗糙度参数。
结果与结论
共聚焦显微镜（CM）
获得了Ti合金种植体对照样品和各处理样品的CM 2D和3D图像数据。示例见下图2。
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A：对照
|
|
|
|
|
|
B：碳酸氢盐喷射 |
|
C：四环素 |
|
|
|
D：超声波 |
|
|
|
E：光动力学疗法 |
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|
图2A–E：Ti合金种植体样品的共聚焦显微镜2D和3D形貌图像： A）对照（未改性的氧化钛（TiO2）表面）；B）碳酸氢盐喷射抛光；C）四环素处理；D）超声处理；E）光动力学疗法处理。所测图像的扫描面积为636µm×477µm。
原子力显微镜（AFM）
只获得Ti合金种植体对照样品的AFM 3D图像数据。以下图3为样品两处不同区域示例。
A
|
|
|
B |
图3A–B：Ti合金对照样品的AFM 3D形貌图像。在样品的两处不同区域拍摄3D图像，扫描面积为10µm×10µm。每个区域的最大z范围为：A）1,219nm（1.22µm），B）1,628nm（1.63µm）。
如上所述，图3A最大的区域z范围为1,219nm（1.22µm），图3B的则为1,628nm（1.63µm），表明这两个区域之间差异大，达25%～35%。
扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线谱（EDS）
SEM和EDS数据显示，碳酸氢盐喷射抛光、四环素处理和光动力学疗法处理的Ti合金样品，其表面污染量比对照样品（未改性的TiO2表面）大。但超声处理的Ti样品与对照样品一样洁净，或比对照样品更洁净。
获得了Ti合金种植体对照样品和各处理样品的SEM和EDS图像数据。以下图4为SEM图像示例，显示局部区域组成的EDS数据则载于表2。
|
A：对照
|
|
|
|
B：碳酸氢盐喷射 |
|
|
C:
|
D：超声波 |
|
|
|
E：光动力学疗法 |
|
|
|
图4A–E：Ti合金对照样品的SEM和EDS数据：A）对照（未改性的TiO2表面）；B）碳酸氢盐喷射抛光；C）四环素处理；D）超声处理；E）光动力学疗法处理。元素 |
表观浓度 |
强度校正 |
浓度（% wt ） |
σ（% wt） |
浓度（% at） |
|
C (Kα) |
0.84 |
0.8750 |
3.37 |
0.32 |
11.84 |
|
Al (Kα) |
1.33 |
0.9636 |
4.87 |
0.16 |
7.61 |
|
Ti (Kα) |
24.46 |
0.9823 |
87.65 |
0.49 |
77.15 |
|
V (Kα) |
1.12 |
0.9632 |
4.11 |
0.39 |
3.40 |
A）对照
|
元素 |
表观浓度 |
强度校正 |
浓度（% wt ） |
σ（% wt） |
浓度（% at） |
|
C (Kα) |
0.31 |
0.7366 |
1.38 |
0.30 |
4.96 |
|
Na (Kα) |
0.78 |
0.9406 |
2.71 |
0.17 |
5.08 |
|
Al (Kα) |
1.38 |
0.9558 |
4.73 |
0.15 |
7.54 |
|
Cl (Kα) |
0.73 |
0.9914 |
2.42 |
0.13 |
2.94 |
|
Ti (Kα) |
25.25 |
0.9793 |
84.65 |
0.49 |
76.02 |
|
V (Kα) |
1.20 |
0.9611 |
4.10 |
0.38 |
3.46 |
B）碳酸氢盐喷射抛光
|
元素 |
表观浓度 |
强度校正 |
浓度（% wt ） |
σ（% wt） |
浓度（% at） |
|
C (Kα) |
1.10 |
0.7748 |
4.18 |
0.35 |
14.02 |
|
Na (Kα) |
0.70 |
0.9430 |
2.20 |
0.15 |
3.86 |
|
Al (Kα) |
1.47 |
0.9586 |
4.52 |
0.14 |
6.75 |
|
Cl (Kα) |
0.63 |
0.9878 |
1.89 |
0.12 |
2.15 |
|
Ti (Kα) |
27.56 |
0.9733 |
83.26 |
0.49 |
70.09 |
|
V (Kα) |
1.29 |
0.9548 |
3.96 |
0.36 |
3.13 |
C）四环素处理
|
元素 |
表观浓度 |
强度校正 |
浓度（% wt ） |
σ（% wt） |
浓度（% at） |
|
C (Kα) |
1.01 |
0.6704 |
1.64 |
0.27 |
6.02 |
|
Al (Kα) |
3.71 |
0.7721 |
5.26 |
0.13 |
6.59 |
|
Ti (Kα) |
79.97 |
0.9864 |
88.67 |
0.37 |
81.60 |
|
V (Kα) |
3.39 |
0.9713 |
3.82 |
0.23 |
3.30 |
|
Fe (Kα) |
0.49 |
0.8683 |
0.62 |
0.13 |
0.49 |
D）超声处理
|
元素 |
表观浓度 |
强度校正 |
浓度（% wt ） |
σ（% wt） |
浓度（% at） |
|
C (Kα) |
0.48 |
0.7767 |
1.95 |
0.30 |
6.93 |
|
Na (Kα) |
0.57 |
0.9356 |
1.95 |
0.15 |
3.62 |
|
Al (Kα) |
1.48 |
0.9582 |
4.92 |
0.15 |
7.79 |
|
Cl (Kα) |
0.49 |
0.9919 |
1.56 |
0.12 |
1.86 |
|
Ti (Kα) |
26.40 |
0.9803 |
85.83 |
0.49 |
76.58 |
|
V (Kα) |
1.15 |
E）光动力学疗法处理
表2A–E：Ti合金样品表面局部区域组成的EDS分析数据，其中Kα为X射线测量值，σ为%wt浓度数据的标准偏差：A）对照样品；B）碳酸氢盐喷射抛光样品；C）四环素处理样品；D）超声处理样品；E）光动力学疗法处理样品。
粗糙度结果
粗糙度分析侧重于以CM获得的Ti合金样品数据，CM可测定三个重要的3D粗糙度参数值： Sa、Sq及Sdar。这些数据示于下文表3。
|
值 |
对照 |
超声波 |
光动力学 |
碳酸氢盐 |
四环素 |
|
Sa（µm） |
1.86 |
0.79 |
1.86 |
1.82 |
1.53 |
|
Sq（µm） |
2.42 |
1.13 |
2.44 |
2.34 |
1.99 |
|
Sdar（%） |
20.51 |
5.03 |
23.10 |
20.46 |
15.99 |
表3：以共聚焦显微镜获得的Ti合金样品表面粗糙度数据。分析侧重于3个粗糙度值：Sa（高度算术平均值）；Sq（高度均方根[rms]）；Sdar（展开面积/投影面积）。
首先，光动力学疗法处理、四环素处理和碳酸氢盐喷射抛光样品的Sa和Sq粗糙度值与对照样品的几乎相同。其次，超声处理样品的Sa和Sq粗糙度值比对照样品的小30%～50%。Sdar粗糙度值显示类似的趋势，不过喷射抛光和四环素处理样品的Sdar值明显小于对照样品（参见以下图5）。
图5：表3中Ti合金种植体样品表面粗糙度数据Sa（蓝色）、Sq（红色）和Sdar（绿色）的曲线图，数据从CM 3D形貌图像获取。曲线图显示每种样品表面粗糙度值的变化程度。
对拍摄于对照样品（未改性）两处不同区域的AFM图像进行初步分析，结果表明，如果表面非常粗糙，其不同小区域的粗糙度值可能差异较大，因此AFM并非用于大面积测量的实用技术，而本研究的这类样品需要这种测量。
|
粗糙度值 |
对照样品区域1 |
对照样品区域2 |
|
Sa（µm） |
0.18 |
0.14 |
|
Sq（µm） |
0.170 |
0.125 |
|
Sdar（%） |
36.80 |
40.10 |
表4：以原子力显微镜获取的Ti合金种植体对照样品区域2表面粗糙度数据。分析侧重于3个粗糙度值：Sa（高度算术平均值）；Sq（高度均方根[rms]）；Sdar（展开面积/投影面积）。
如上文表4所示，两个区域的Sdar值相差约10%，Sq值相差约35%，Sa值相差约30%。另一方面，AFM图像显示z范围差值超过1µm的峰和山，这对于AFM分析而言属于大差异，会导致图像中存在伪影，即可能由于顶端扫描样品时碰触表面而产生的“条纹”。总而言之，AFM图像结果取决于样品形貌和力学性能、反馈回路增益、扫描速率等。
总结和结论
目前临床上使用的Ti合金牙种植体具有各种各样的表面特性（包括结构特征和化学性质）。上述表面改性保留种植体的关键物理性质，只涉及其最外层表面，最终目标为实现所需的生物反应。以上介绍了不同物理化学、物理和化学表面改性方法的优劣。这些方法将帮助我们更好地了解种植体材料表面改性如何影响骨-种植体界面，以及如何在成功治疗种植体周围炎（种植体周围牙质组织感染）后的愈合过程中影响种植体骨整合优化方法的制定。目前尚未完全清楚表面粗糙度和化学性质对骨整合的影响程度。具有最佳临床效果的理想粗糙度仍是个未知数[20–23]。
对于用四环素和光动力学疗法改性的样品，其形态受到钛合金析出的金属间颗粒化学侵蚀的影响。对于用喷射抛光和超声处理改性的样品，机理主要与力学相关。喷射抛光和光动力学疗法处理样品的表面粗糙度与对照样品相似（基于Sa、Sq和Sdar值）。超声和四环素处理样品的表面粗糙度低于对照样品。事实上，超声处理可使表面明显变得平坦。
碳酸氢盐喷射抛光样品的污染程度最大（盐残留），其次为四环素和光动力学疗法处理样品，超声处理样品污染最少。由于接触到盐（碳酸氢盐）或化合物（四环素或甲苯胺蓝），喷射抛光、四环素及光动力学疗法处理的Ti合金样品污染程度最大，这是显而易见的。超声处理的样品与对照样品一样洁净，或比对照样品洁净，不过也存在少量的铁（Fe），这些铁可能来自超声处理所用的钢探头。
可以通过合理使用这些牙科处理方法，最大可能提高种植体周围炎愈合过程Ti合金种植体与骨结合的概率。也许可以先使用光动力学疗法或碳酸氢盐喷射抛光（频率较低，比如20kHz，功率亦较低）维持种植体的表面粗糙度，然后施以短暂轻微的超声处理，或可有效净化表面。
参考文献
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致谢
本文作者衷心感谢徕卡显微系统 James DeRose 对结果作出的有益讨论和评论，以及对手稿的校对工作，还感谢 Aranzazu Villuendas (CCiTUB) 对 SEM 结果作出的有益讨论。
