基于量子点的单分子荧光示踪技术揭示分子马达的行走机制

在生物体内，分子马达参与肌肉收缩、胞质运输、DNA转录以及有丝分裂等一系列重要的生命活动。在执行上述功能过程中，分子马达需要借助ATP水解释放的能量，完成在细胞骨架上的特定运行轨迹。因此，关于分子马达沿着细胞骨架的行走机制的研究，对于深刻认识分子马达的作用机制，以及相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。美国霍华德·休斯医学研究所的Ronald D. Vale课题组，应用单分子荧光标记与示踪技术，揭示了分子马达之一——动力蛋白（Dynein）在微管骨架上的行走特性（图1）。

Ronald D. Vale等构建了动力蛋白与HaloTag的融合蛋白表达载体，经出芽酵母表达，向纯化的融合蛋白加入HaloTag生物素配基，获得生物素化的动力蛋白。为了与链霉亲合素偶联的量子点（Streptavidin-Quantum dots, SA-QDs）进行标记，将生物素化的动力蛋白置于体外反应池，首先在没有ATP的条件下与轴丝（axonemes）结合，再与SA-QDs孵育。经过上述反应，动力蛋白被量子点标记，同时可避免由SA-QDs引发的动力蛋白聚集。

研究人员利用上述量子点标记的动力蛋白，应用高敏感性和高分辨率的荧光成像技术，分析了动力蛋白在微管骨架上的步进行为特性（图2）。量子点的高荧光亮度和耐光漂白特性，可以满足精确示踪的要求；同时，量子点的高荧光稳定性使示踪时程可持续数分钟。数据分析显示，对动力蛋白头部和尾部进行的量子点标记，对其步进功能没有干扰。总之，上述单分子荧光标记与示踪技术，从分子水平揭示了马达蛋白的行为特性，丰富了分子马达的基础理论研究，相关成果发表于《CELL》。

图1动力蛋白在微管骨架上的行走模式图（Spudich JA, Cell 2006）

图2 量子点标记的动力蛋白在微管骨架上的步进行为

文献来源：

Reck-Peterson SL, Yildiz A, Carter AP, Gennerich A, Zhang N, Vale RD. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 2006;126(2):335-48.