侧脑室注射1922IgG2saporin致痴呆动物模型的实验研究
摘 要
建立老年性痴呆模型大鼠,并观察其学习记忆能力及基底前脑胆碱能神经元数目的变化。在成年SD大鼠左侧侧脑室注射免疫毒素1922IgG2saporin(2. 5μg/5μl) , 3周后行Y迷宫检测其学习和记忆能力; 4周后处死大鼠,采用免疫组化结合图像分析技术观察各组大鼠基底前脑ChAT阳性神经元数目的变化。结果显示:模型组大鼠的学习记忆能力与正常组相比明显下降(P<0. 01);模型组基底前脑的内侧隔核(MS)和斜角带垂直部(VDB)胆碱能神经元数目分别减少至正常组的9. 70%和14.09%,与正常组相比均明显下降(P<0. 01);学习、记忆能力与基底前脑胆碱能神经元数目密切相关。上述结果表明应用1922IgG2saporin免疫毒素能成功建立AD大鼠动物模型,该模型可用于抗痴呆药物的筛选及药效的评价。Alzheimer病(AD)的主要症状是进行性认知功能障碍和学习记忆能力损害,其发病率随年龄的增大而增高。迄今为止,由于AD的发病机理非常复杂,故在临床上缺乏有效的治疗措施。建立一个可靠的AD动物模型是研究AD的重要环节,近年来国内外学者为探讨AD的发病机理和开发有效的治疗药物,曾建立了一些AD模型,但目前还没有一个理想的模型能够再现该病的所有特征。脑内乙酰胆碱(ACh)能神经系统的退行性变被认为是造成AD的主要病理因素之一,本实验应用具有选择性免疫毒素1922IgG2saporin[124]在成年SD大鼠一侧侧脑室注射来建立AD动物模型,并观察其学习记忆能力及基底前脑胆碱能神经元的变化。
材料与方法
1. 材料
乙酰胆碱转移酶(ChAT)单克隆抗体购自Chemicon公司, Ultrasensitive SP试剂盒、DAB显色试剂盒均为MaxinBiotech Inc. 公司产品。成年雄性Sprague2Dawley(SD)大鼠24只,体重250～300g,随机分为: (1)正常组(n=8); (2)生理盐水组(n =8):左侧侧脑室注射生理盐水溶液5 μl; (3)模型组(n=8):左侧侧脑室注射1922IgG2sa2porin溶液2. 5μg/ 5μl。
2.动物模型制作
模型组大鼠用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)行腹腔注射,动物麻醉后采用平头颅位固定于立体定位仪上。全部器械以1%新洁而灭溶液浸泡过夜(加1%亚硝酸钠防锈)。依次用3%碘酒、75%酒精消毒。沿颅顶正中矢状位切开头皮,刮除骨膜,用3%H2O2 烧灼。使颅骨发白,用消毒棉签充分推开伤口,参照大鼠立体定位图谱,以前囟为零点,按前囟后0. 8mm,外侧1. 5mm坐标用7号针头把颅骨钻一孔,用10μl微量进样器取1922IgG2saporin 2. 5 μg / 5 μl,从该孔垂直进针,针深至腹侧5. 5mm,缓慢匀速推注,时间不少于5min,再留针3min。伤口消毒,缝合皮肤。生理盐水组用同样的方法注射5μl的生理盐水。饲养3周后,进行Y迷宫行为检测。4周后处死大鼠,采用免疫组化结合图像分析技术观察各组大鼠基底前脑ChAT阳性神经元数目的变化。
3. Y迷宫行为检测
3周后,各组大鼠在三等份辐射式迷宫箱中进行检测,箱的每支臂顶端装有信号灯,灯亮区为安全区,安全区的方位随机变换。选用电压70V电击延时30s。训练大鼠学会分辨安全信号灯而主动逃避电击。在条件性回避反应建立后,每天分上、下午各给大鼠10次测试,连续训练6d,其间10次测试中有9次以上正确为学会标准。记录每只大鼠达到学会标准所需训练次数为学习能力(次数越少,表示学习能力越强,反之越弱);到达学会标准24h后再进行一轮测试,正确次数为记忆能力(次数多,表示记忆力强,反之弱)。
4. 组织切片制作及染色
麻醉动物,经左心室2升主动脉快速连续灌注200ml生理盐水,至肝脏颜色变白后再灌注4%多聚甲醛溶液250ml(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4),按先快后慢的原则, 60min内灌注完毕。迅速开颅取脑,置于4℃的同样固定液中后固定约2～4h,然后将脑组织移入15%的蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4)中置4℃冰箱过夜,再入30%蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4)4℃过夜。脑组织用恒冷箱切片机作冠状连续切片,片厚40μm,用PBS收集切片。切片始于胼胝体交叉的起始水平,止于前连合交叉前缘,每隔3片取2片,按ABC法进行免疫组化染色。切片首先用0. 01mol/L的PBS(pH7. 2)洗5min×3次;每张切片加一滴过氧化物酶阻断剂处理30min, PBS洗5min×3次;进而加一滴正常非免疫动物血清处理30min;吸干试剂后,每张切片再加50μl ChAT单克隆抗体溶液(1∶800),于4℃冰箱孵育过夜。此日用PBS洗5min×3次;依据上述方法,按顺序分别加生物素标记的二抗和链霉素抗生素蛋白-过氧化酶,最后每张切片加新鲜配制的DAB显色液(850ml双蒸水加DAB试剂盒A、B、C各1滴)50μl显色3～6min,镜下观察显色满意以后用PBS漂洗,贴片,凉干后梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
5. 电脑采图及计数
每只大鼠选取隔2斜角带复合体5个代表平面,每个平面在低倍镜(4 ×)下选择一侧内侧隔核
(MS)和斜角带垂直部(VDB)观察视野,再于中倍镜(20×)下以2个视野包括MS和VDB细胞密集区,使用全自动图像分析系统(德国KONTRONIBAS2. 0,JVCky2F30B32CCD彩色图像摄录输入仪)显示视野,通过图像分析处理,对阳性神经元的数目、面积和周长进行定量检测;高倍镜下(40×)观察神经元形态。
6. 统计学方法
所有实验数据均为计量资料,用均数±标准差(�x±s)表示。用SPSS11. 0统计软件进行统计学分析,各组资料的比较采用t检验,两变量的相关性采用直线相关回归分析。
结 果
1. 各组大鼠学习记忆能力的比较Y迷宫检测各组大鼠学习、记忆能力的结果见表.经配对t检验显示:模型组大鼠的学习、记忆能力明显下降,与正常组和生理盐水组比较均有显
著性差异(P<0. 01)。
