植物病毒分离方案

 

带病毒的植物叶、茎、果实、根等粉碎后—20℃冰冻后制成匀浆→用0.5M，PH7.0柠檬酸缓冲液抽提→双层纱布过滤→滤液加入6%PEG（MW6,000）及3%Nacl，充分搅拌40分钟，置冰箱4℃过夜→高速冷冻离心机8×50ml转头，7000rpm，4℃离心20分钟，弃上清，取沉淀→沉淀是浮于0.005M，PH8.5的硼酸缓冲液（含0.05M尿素或1%，Triton X-100）中，7000rpm，4℃离心20分，取上清液→超速离心：10%～40%蔗糖梯度，日立P40ST转头30,000rpm，4℃离心3小时→每管自上而下收集成30管，每管约400μl，分别做260nm及280nm O.D.，绘成曲线，收集病毒带（峰前后收集管）。根据260nm及280nm的O.D.值的比值估计样品的纯度

 

带病毒的植物叶、茎、果实、根等粉碎后—20℃冰冻后制成匀浆→加5倍体积的0.1M，PH8.2的硼酸缓冲液（含2%PVP，2%尼古丁，0.01M EDTA和0.2%硫基乙醇）搅拌，双层纱布过滤→滤液在高速冷冻离心机6,000rpm，4℃离心20分→取上清液，加入6%PEG（MW6000），0.1M Nacl和1% Triton X-100，冰浴中搅拌至完全溶解，4℃过夜→高速机10,000rpm，4℃离心30分钟→取沉淀，悬浮于0.01M PH7.2的磷酸缓冲液（含0.001M EDTA和0.1% PVP）10,000rpm，4℃离心30分钟→取上清液，P40ST转头每管内铺5ml用以上悬浮液配置的20% w/w蔗糖（分析纯），上部铺上清液至距管口3mm，35,000rpm，4℃离心3小时→取沉淀，用以上悬浮物稀释后10,000rpm，4℃离心20分→取上清液，P40ST转头，10%～40%蔗糖梯度，每管样品约1ml，28,000rpm，4℃，3.5小时→从上部开始收集成30管，每管约400μl，分别测O.D.，绘成管数（横坐标）对O.D.（竖坐标）曲线，找到病毒峰所在离心管（取3-5管）→稀释后40,000rpm，4℃离心2小时→沉淀，悬浮即为纯病毒成份。