“质粒DNA超速离心分离”的补充说明

  “质粒DNA超速离心分离”的补充说明 

一）用CSCL-E.B.梯度分离大肠杆菌中质粒DNA、染色体DNA、蛋白质及RNA的详细步骤

（1）    溶液制备：

溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，10mM EDTA,25 mM Tris-HCL (PH8.0)。

溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1%SDS。

溶液Ⅲ：3M醋酸钠（PH4.8）

TE缓冲液：10 mM Tris-HCL (PH7.4)，2mM EDTA

（2）    E.coli培养液1升。（实验应用时可按比例增加或减少）

（3）    将1L培养液在4000rmp（约20000xg），5℃离心20分钟，得到细菌沉淀。

（4）    用100ml冷的溶液Ⅰ洗沉淀，再离心，4000rmp，5℃离心20分。

（5）    用20ml冷的溶液Ⅰ将第二次沉淀调成均匀悬浮液。

（6）    每ml加入2mg溶菌酶，并在0℃冰中放置10分钟。

（7）    加入40ml溶液Ⅱ，轻轻搅拌后在冰浴中置5分钟。

（8）    加入30ml溶液Ⅲ，在冰浴中放置20分钟，使蛋白质大部分沉降。

（9）    在高速冷冻离心机上，用角式转头10000rmp（约10000xg）离心15分钟，5℃。

（10）小心地倒去上清（不搅拌沉淀）。在沉淀中加入55ml异丙醇（Isopropanol），即得到粗制的质粒DNA溶液。

（11）粗制DNA液在-20℃。在重力状态下沉淀15分钟以上，再在12000rpm（15000xg）4℃离心5分钟，倒去上清液。

（12）真空中抽去异丙醇，沉淀中加入18ml经消毒过的TE缓冲液，在沉淀溶解后，再加入0.65ml 1%的E.B.（共约35ml-40ml）。

（13）以上溶液每ml加入分析纯CSCL1.0克，并使其完全溶解，检测溶液折射率应为1.3890（ρ=1.587）

（14）用以上溶液作质粒DNA的超速离心分离，用12ml，PA密封管，角转头100000xg36hr，20℃，小倾角转头78000rpm x 4hr或垂直管转头350000xg 6hr，20℃

（15）离心后，在紫外光下（最好用300nm紫外光，对DNA损伤最小），可显示DNA带（即线性DNA带与质粒DNA带），RNA沉淀底部，蛋白质浮在顶部。

（16）用切管器切去管上部，抽出质粒DNA（管中部附件，有二个带，上部是线性DNA带，下部是质粒DNA带）。

      也可以直接从侧壁穿刺抽出质粒DNA

      最好是用梯度仪用上取法自上而下抽出后经流动池测OD，绘出ABS曲线，再分部收集。

（17）从溶液中抽提E.B.用透析法或脱盐柱去CSCL。

（18）如果不用E.B.可以用三氟醋酸铯作为梯度介质。但不可用E.B.时，分离后看不出质粒DNA带位置，三氟醋酸铯离子吸收紫外线，使分析更困难，此法不常用。

二） E.B.（ethidium bromide,溴化乙锭）的作用

（1）降低了DNA在CSCL中浮密度，以SV 40 DNA为例，无E.B.时，其在CSCL中浮密度为1.71，有E.B.时降为1.575。减少了CSCL使用量，缩短了离心时间，降低了离心成本。

（2）使质粒DNA纯样品带在紫外光照射下显色，从而在超速分离后易于识别Plasmid DNA带的位置，便于抽出。

（3）E.B.的存在使质粒DNA与线粒体DNA在CSCL中的浮动密度差减少。使二个带靠得较近。但用超离心分离方法，还是可以将二种DNA分开。（线性DNA与质粒DNA在CSCL中浮密度分别为1.532和1.575）。

作者：余兴明   电话：13764301893,yuxingming@techcomp.cn