关于温度梯度PCR和降落PCR

  温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR，每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分别为50，52，54，56，58，60度），最后看看哪个温度的效果最好。总之是用来进行退火温度优化的。

  降落PCR是在同一个PCR管内进行PCR，只是每个循环的温度不同（如每个循环降1度）。一般兼并引物用这种方法多些。

降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术：

　设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。

　由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。

　例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。

　则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。

　实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。