Real Time PCR—Cycleave PCR法原理
| ■ CycleavePCR法原理 |
| CycleavePCR法是由RNA和DNA构成的杂合Cycling 探针与RNase H组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的基因。Cycling 探针内部夹有RNA部分，5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。如果探针的RNA部分或与RNA部分相邻的2 ~ 3个碱基与模板不互补，RNase H就不能在RNA部分将探针切断，所以该检出方法是一种即使一碱基不同也能识别的高特异性检出方法，特别适合于SNP解析。 Cycling 探针碱基数少，一般为十二个碱基左右，荧光报告基团和淬灭基团的距离近，淬灭效果好，荧光背景低，信噪比高。具体原理详见图1： |
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| 图1 Cycling 探针法原理 |
| ■ 利用CycleavePCR法的SNP解析原理 |
| CycleavePCR法在SNP分型解析方面具有强大的优势。使用CycleavePCR法进行SNP解析，在设计探针时，把多型位点或与其相邻的第2 ~ 3个碱基设计成RNA，使用不同的荧光物质分别标记野生型和突变型探针，通过对两种不同荧光物质进行双通道同步检测，实现对每个检测样品的SNP位点的基因型判定。 |
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