影响双向电泳分离效果的若干实验条件比较研究
陈华 ，刘树滔 ，温腾 ，原山武 ，久保田英博 ，饶平凡
(1．福州大学生物工程研究所，福建福州350002；2．日本ATI''''O公司技术开发部，东京113—8425)
摘要：对第一向为载体两性电解质pH梯度等电聚焦双向电泳(Iso—DALT)中若干影响分离效果的实验条件进行了研究．结果发现，琼脂糖和尿素的纯度明显影响分离效果；加丙烯酰胺或碘乙酰胺保护经二硫苏糖醇还原的样品中的巯基，可以显著减少假斑点；厚度较薄的分离胶的分离效果较好；以琼脂糖为两性电解质载体代替聚丙烯酰胺的第一向等电聚焦电泳使分子量1 Da以上蛋白质得以分离．
关键词：双向电泳；载体两性电解质；实验条件
中图分类号：Q5—33；Q510．2 文献标识码：A
Efect of experimental conditions on the resolution of
the two-dimensional electrophoresis
CHEN }hla ，LIU Shu—taoI，WEN Teng’，HARAYAMA Takeshi ，KUBOTA Hidehiro2，RAO Ping—fanI
(1．Institute of Biotechnology，Fuzhou University，Fuzhou，F~jian 350002，China；2．The Department of R&D，
ATYO Corporation，Tokyo 113—8425，Japan)
Abstract：The efect of several experimental conditions on the result of ISO ——DALT was investigated in
this paper．It was found that the purity of agarose and urea dramatically influenced the separation，the
addition of acrylamide or iodoacetamide into the sample reduced by DTI"could decrease the pseudo dots
of protein，thinner separating gel exhibited better efect，the replacement of agarose for polyacrylamide as
carrier of am phelyte could separate protein with molecular weight more than 1 Da．
Keywords：two— dimensional electrophoresis；carrier am phelyte；experimemal co ndition
双向电泳方法按第一向等电聚焦的不同，可以分为载体两性电解质pH梯度双向电泳和固相pH梯度双向电泳．目前，载体两性电解质pH梯度双向电泳方法由于蛋白溶解性低、重现性低、蛋白上样量低，使其应用受到限制n】．但固相pH梯度双向电泳方法存在着固相胶条昂贵，固相pH梯度灌胶技术复杂，并且只能用聚丙烯酰胺做载体，不能分离分子量大于lo''''Da的蛋白质等问题．因此，第一向为载体两性电解质pH梯度等电聚焦(ISO—DALT)的双向电泳方法仍有其存在的合理性和改进的必要性．对蛋白质双向电泳双胺染色法的研究发现 】，含有Na2 S20，非双胺染液染色后胶表面背景深，星褐黄色，影响蛋白质点检测，特别影响低表达蛋白质点检测．不含Na2 S20，双胺染液染色胶表面无任何背景，蛋白质点异常清晰．但该研究并未对试剂纯度(如琼脂糖和尿素)、分离胶的厚度、样品经还原处理后巯基的保护和两性电解质载体等影响因素进行进一步的分析．为此，作者比较分析了影响其电泳效果的若干因素，找出提高该方法分离效果和范围的途径，从而提高该方法的可用性．
1 材料和方法
1．1 材料、试剂和仪器
利乐装市售牛奶，鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)粗品，肝细胞．两性电解质Ampholine(pH 3．5—10，pH 4—6．5)和进口等电聚焦琼脂糖均购自Amemham Biosciences；
收稿日期：2005—01—18
作者简介：陈华(1977一)，女，硕士研究生；通讯联系人：刘树滔，副教授．
D一山梨醇(High Pure)、N，N’一甲叉双丙烯胺、CHAPS、TEMED、SDS、Glycine和Triton均购自生物工程上海有限公司；进口尿素(Ultra Pure)、Tris和D，I’I’均购自BIO BASIC INC；国产琼脂糖购自BIOASIALtd．；低分子量标准蛋白质购自上海东风制药厂；国产丙烯酰胺(化学纯)．其余试剂均为国产分析纯．双向电泳(ATro公司，AE一7341和AE一6541)，全自动交流稳压电源(中国天正集团有限公司)，超纯水仪器(法国MILLIPORE)，离心机(飞鸽牌TDL一5一A)，扫描仪(EPSON perfection 1200 PHOTO)．
1．2 方法
市售利乐装牛奶用蒸馏水搅拌透析过夜，4℃保存．蛋黄液用蒸馏水7倍稀释，经一20℃冷冻处理6 h后，于20℃以下的温度解冻，添加3％硅藻土，在3 Pa(400 ml''''n Hg)真空度下，以0．45 m的混合纤维素脂膜为载体抽空过滤，将所得滤液水溶性组分调整至含有75 mmol／L磷酸钠缓冲液pH7．0后，上样到DEAE Toyopearl 650 M阴离子交换色谱，用150 mmol／L磷酸钠缓冲液pH7．0洗脱，经SDS—PAGE检验为单一组成．冻成干粉，4℃保存．大鼠肝脏取出用PBS冲洗，称重，放置在冰上用手术剪剪碎，加入l0倍量的淋洗液(50 mmol／L Tris— HC1 pH 8．0，0．1M NaC1，0．1M EDTA)，再加入蛋白酶K 100／zL(100 mg／L)，去除细胞膜后得到肝细胞内容物．溶液配置、样品处理、第一向等电聚焦，SDS—PAGE和固定，染色，脱色，以及扫描参见文献[3]．
2 结果
2．1 试剂纯度的比较
用牛奶做材料，分别以进口和国产琼脂糖、尿素为载体进行等电聚焦，结果(图1)显示，牛奶中蛋白含量主要是酪蛋白和乳清蛋白，平均分子量为2×105 Da左右，酪蛋白等电点为4．6，有口．．，口 ，卢和4种类型，乳清蛋白等电点为5．2，有口和 2种类型．在2张电泳图上均可看见两个清晰的斑点，其中1为酪蛋白，2为乳清蛋白，纵向上与这两点相平行的条带分别为两种蛋白的不同类型．
从图1可以看出，使用进口琼脂糖电泳(图l(a))形成的1和2两个斑点较圆，而使用国产琼脂糖形成(图l(b))的同样两个斑点则有横向拖尾现象．另外，用电阻值为14 Mr2的水制备等电聚焦胶条时，用进口琼脂糖配胶可固化成型，而用国产琼脂糖配胶不能固化成型或胶质过软，改用电阻值为18 Mgl的Mili—Q水，国产琼脂糖配胶亦可固化成型．由此可见，进口琼脂糖优于国产琼脂糖．比较进口尿素(图1(c))和国产尿素(图1(d))对电泳结果的影响，可以看到，使用进口尿素进行电泳形成的1和2两个斑点较圆，而使用国产尿素形成的1和2两个斑点也有横向拖尾现象，且清晰度下降．可见，不同来源的试剂对分离结果有影响，进口尿素分离效果要优于国产试剂．进口试剂(琼脂和尿素)优于国产相应试剂的原因可能是，进口试剂相比国产试剂纯度高、离子含量较低．另外，电阻值高的水，由于离子含量少，可以缩短凝胶固化时间．
2．2 还原样品中巯基的影响
图2、图3分别为肝细胞样品和牛奶样品加还原剂后加与不加巯基保护剂的电泳结果比较．与图2(a)、图2(b)比较，图2(c)斑点数量明显减少，还出现一些假斑点．与图3(a)比较，图3(b)点2和3消失，也出现4和5两个假斑点．斑点减少是因为加还原剂打开二硫键后形成的巯基若未及时保护，会很快重新形成二硫键，出现假斑点是因为二硫键打开后部分巯基交叉形成新的二硫键．因此，若使用还原剂处理样品，应及时加入巯基保护剂，以避免斑点减少并出现假斑点．以往样品经还原处理后，不再加试剂保护形成的巯基，一般认为这种做法对蛋白的电泳分离效果并无影响，但经本次试验可明显看出样品还原处理后保护形成的巯基是十分必要的，否则很有可能导致错误的分析结果．
2．3 第二向SDS—PAGE中分离胶厚度的影响
袁泉等人曾使用固定pH梯度(IPG)凝胶双向电泳系统观察同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统(大型和中型凝胶)的双向电泳图，认为分离效果有较大差异 ．笔者采用的小胶是300 V下电泳45 min，大胶是120 V、16～24 mA下电泳165 min，染色与脱色时间大胶均长于小胶，小胶电泳电压远高于大胶因而电泳时间明显缩短，小胶比大胶薄因而染色和脱色时间少于大胶，并且分离效果优于大胶，蛋白斑点更清晰，电泳效果见图4．虽然胶变大有利于蛋白的分离，但胶的厚度变大，横向扩散效应比薄胶明显，与胶的长度相比，胶的厚度成为影响分离效果的主导因素，因而厚胶分离效果不如薄胶．
2．4 载体为琼脂糖时对分子量10万以上蛋白的分离鸡卵黄免疫球蛋白IgY是大分子量蛋白，分子量约为15×105 Da，等电点为5．4—5．5．由于其分 子量较大，以聚丙烯酰胺为等电聚焦电泳载体无法将其区分．而改用琼脂糖凝胶作为等电点电泳的分离载体，使传统上用聚丙烯酰胺为等电聚焦电泳载体无法分离的大分子蛋白(M，>100 kDa，如鸡卵黄免疫球蛋白(IgV))的点在双向电泳图上得到了确认，说明以琼脂糖为载体可以分离100 kDa以上的蛋白质，这是因为琼脂糖凝胶孔径比聚丙烯酰胺大．电泳效果见图5．
参考文献：
[1] Kortt Michael A，Bootman J Lyle．Phytotherapy in treatment of benign prostatic hyperphsia：a critical review[J]．Cl／nical Thempeutics，
1996，18(6)：1 227—1 241．
[2] 郭应禄．泌尿外科专集(一)：前列腺增生及前列腺癌[M]．北京：人民卫生出版社，1998．1—24．
[3] 蒋晟，廖清江．甾体5a一还原酶抑制剂的研究进展[J]．中国新药杂志，20OO，9(7)：438—442．
[4] Eli Lilly，Company．LY 191701：type 1 steroid5a—reductase inhibitor treatment ofandrogenic alopecia[J]．DrIlgs Fut，1995，20
(2)：144—147．
[5] 孙祖越，吴建辉，屠曾宏．一个简捷的甾体5a一还原酶抑制剂体外筛选模型[J]．上海实验动物科学，2002，22(4)：
204—2O8．
[6] 孙祖越，郑维君，王晓麟，等．甾体5a一还原酶活性的新测定方法[J]．中华内分泌代谢杂志，1998，14(3)：2O6—
207．
[7] 董晓燕．生物化学实验[M]．北京：化学工业出版社，2003．
[8] 崔毓桂，张桂元．正常成年男性5a一还原酶活性的测定[J]．生殖医学杂志，1995，4(1)：11—15．
【9J lmperato—McGinley J，Sanchez R S，Sponger J R，et ．Coml~ son ofthe e~ects ofthe 5 alph —reductsse inhibitorfinasteride
and the antiandrogen thtamide on prostate and genital diferentiation：dose—response studies[J]．Endecrinology，1992，131(3)
(1．福州大学生物工程研究所，福建福州350002；2．日本ATI''''O公司技术开发部，东京113—8425)
摘要：对第一向为载体两性电解质pH梯度等电聚焦双向电泳(Iso—DALT)中若干影响分离效果的实验条件进行了研究．结果发现，琼脂糖和尿素的纯度明显影响分离效果；加丙烯酰胺或碘乙酰胺保护经二硫苏糖醇还原的样品中的巯基，可以显著减少假斑点；厚度较薄的分离胶的分离效果较好；以琼脂糖为两性电解质载体代替聚丙烯酰胺的第一向等电聚焦电泳使分子量1 Da以上蛋白质得以分离．
关键词：双向电泳；载体两性电解质；实验条件
中图分类号：Q5—33；Q510．2 文献标识码：A
Efect of experimental conditions on the resolution of
the two-dimensional electrophoresis
CHEN }hla ，LIU Shu—taoI，WEN Teng’，HARAYAMA Takeshi ，KUBOTA Hidehiro2，RAO Ping—fanI
(1．Institute of Biotechnology，Fuzhou University，Fuzhou，F~jian 350002，China；2．The Department of R&D，
ATYO Corporation，Tokyo 113—8425，Japan)
Abstract：The efect of several experimental conditions on the result of ISO ——DALT was investigated in
this paper．It was found that the purity of agarose and urea dramatically influenced the separation，the
addition of acrylamide or iodoacetamide into the sample reduced by DTI"could decrease the pseudo dots
of protein，thinner separating gel exhibited better efect，the replacement of agarose for polyacrylamide as
carrier of am phelyte could separate protein with molecular weight more than 1 Da．
Keywords：two— dimensional electrophoresis；carrier am phelyte；experimemal co ndition
双向电泳方法按第一向等电聚焦的不同，可以分为载体两性电解质pH梯度双向电泳和固相pH梯度双向电泳．目前，载体两性电解质pH梯度双向电泳方法由于蛋白溶解性低、重现性低、蛋白上样量低，使其应用受到限制n】．但固相pH梯度双向电泳方法存在着固相胶条昂贵，固相pH梯度灌胶技术复杂，并且只能用聚丙烯酰胺做载体，不能分离分子量大于lo''''Da的蛋白质等问题．因此，第一向为载体两性电解质pH梯度等电聚焦(ISO—DALT)的双向电泳方法仍有其存在的合理性和改进的必要性．对蛋白质双向电泳双胺染色法的研究发现 】，含有Na2 S20，非双胺染液染色后胶表面背景深，星褐黄色，影响蛋白质点检测，特别影响低表达蛋白质点检测．不含Na2 S20，双胺染液染色胶表面无任何背景，蛋白质点异常清晰．但该研究并未对试剂纯度(如琼脂糖和尿素)、分离胶的厚度、样品经还原处理后巯基的保护和两性电解质载体等影响因素进行进一步的分析．为此，作者比较分析了影响其电泳效果的若干因素，找出提高该方法分离效果和范围的途径，从而提高该方法的可用性．
1 材料和方法
1．1 材料、试剂和仪器
利乐装市售牛奶，鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)粗品，肝细胞．两性电解质Ampholine(pH 3．5—10，pH 4—6．5)和进口等电聚焦琼脂糖均购自Amemham Biosciences；
收稿日期：2005—01—18
作者简介：陈华(1977一)，女，硕士研究生；通讯联系人：刘树滔，副教授．
D一山梨醇(High Pure)、N，N’一甲叉双丙烯胺、CHAPS、TEMED、SDS、Glycine和Triton均购自生物工程上海有限公司；进口尿素(Ultra Pure)、Tris和D，I’I’均购自BIO BASIC INC；国产琼脂糖购自BIOASIALtd．；低分子量标准蛋白质购自上海东风制药厂；国产丙烯酰胺(化学纯)．其余试剂均为国产分析纯．双向电泳(ATro公司，AE一7341和AE一6541)，全自动交流稳压电源(中国天正集团有限公司)，超纯水仪器(法国MILLIPORE)，离心机(飞鸽牌TDL一5一A)，扫描仪(EPSON perfection 1200 PHOTO)．
1．2 方法
市售利乐装牛奶用蒸馏水搅拌透析过夜，4℃保存．蛋黄液用蒸馏水7倍稀释，经一20℃冷冻处理6 h后，于20℃以下的温度解冻，添加3％硅藻土，在3 Pa(400 ml''''n Hg)真空度下，以0．45 m的混合纤维素脂膜为载体抽空过滤，将所得滤液水溶性组分调整至含有75 mmol／L磷酸钠缓冲液pH7．0后，上样到DEAE Toyopearl 650 M阴离子交换色谱，用150 mmol／L磷酸钠缓冲液pH7．0洗脱，经SDS—PAGE检验为单一组成．冻成干粉，4℃保存．大鼠肝脏取出用PBS冲洗，称重，放置在冰上用手术剪剪碎，加入l0倍量的淋洗液(50 mmol／L Tris— HC1 pH 8．0，0．1M NaC1，0．1M EDTA)，再加入蛋白酶K 100／zL(100 mg／L)，去除细胞膜后得到肝细胞内容物．溶液配置、样品处理、第一向等电聚焦，SDS—PAGE和固定，染色，脱色，以及扫描参见文献[3]．
2 结果
2．1 试剂纯度的比较
用牛奶做材料，分别以进口和国产琼脂糖、尿素为载体进行等电聚焦，结果(图1)显示，牛奶中蛋白含量主要是酪蛋白和乳清蛋白，平均分子量为2×105 Da左右，酪蛋白等电点为4．6，有口．．，口 ，卢和4种类型，乳清蛋白等电点为5．2，有口和 2种类型．在2张电泳图上均可看见两个清晰的斑点，其中1为酪蛋白，2为乳清蛋白，纵向上与这两点相平行的条带分别为两种蛋白的不同类型．
从图1可以看出，使用进口琼脂糖电泳(图l(a))形成的1和2两个斑点较圆，而使用国产琼脂糖形成(图l(b))的同样两个斑点则有横向拖尾现象．另外，用电阻值为14 Mr2的水制备等电聚焦胶条时，用进口琼脂糖配胶可固化成型，而用国产琼脂糖配胶不能固化成型或胶质过软，改用电阻值为18 Mgl的Mili—Q水，国产琼脂糖配胶亦可固化成型．由此可见，进口琼脂糖优于国产琼脂糖．比较进口尿素(图1(c))和国产尿素(图1(d))对电泳结果的影响，可以看到，使用进口尿素进行电泳形成的1和2两个斑点较圆，而使用国产尿素形成的1和2两个斑点也有横向拖尾现象，且清晰度下降．可见，不同来源的试剂对分离结果有影响，进口尿素分离效果要优于国产试剂．进口试剂(琼脂和尿素)优于国产相应试剂的原因可能是，进口试剂相比国产试剂纯度高、离子含量较低．另外，电阻值高的水，由于离子含量少，可以缩短凝胶固化时间．
2．2 还原样品中巯基的影响
图2、图3分别为肝细胞样品和牛奶样品加还原剂后加与不加巯基保护剂的电泳结果比较．与图2(a)、图2(b)比较，图2(c)斑点数量明显减少，还出现一些假斑点．与图3(a)比较，图3(b)点2和3消失，也出现4和5两个假斑点．斑点减少是因为加还原剂打开二硫键后形成的巯基若未及时保护，会很快重新形成二硫键，出现假斑点是因为二硫键打开后部分巯基交叉形成新的二硫键．因此，若使用还原剂处理样品，应及时加入巯基保护剂，以避免斑点减少并出现假斑点．以往样品经还原处理后，不再加试剂保护形成的巯基，一般认为这种做法对蛋白的电泳分离效果并无影响，但经本次试验可明显看出样品还原处理后保护形成的巯基是十分必要的，否则很有可能导致错误的分析结果．
2．3 第二向SDS—PAGE中分离胶厚度的影响
袁泉等人曾使用固定pH梯度(IPG)凝胶双向电泳系统观察同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统(大型和中型凝胶)的双向电泳图，认为分离效果有较大差异 ．笔者采用的小胶是300 V下电泳45 min，大胶是120 V、16～24 mA下电泳165 min，染色与脱色时间大胶均长于小胶，小胶电泳电压远高于大胶因而电泳时间明显缩短，小胶比大胶薄因而染色和脱色时间少于大胶，并且分离效果优于大胶，蛋白斑点更清晰，电泳效果见图4．虽然胶变大有利于蛋白的分离，但胶的厚度变大，横向扩散效应比薄胶明显，与胶的长度相比，胶的厚度成为影响分离效果的主导因素，因而厚胶分离效果不如薄胶．
2．4 载体为琼脂糖时对分子量10万以上蛋白的分离鸡卵黄免疫球蛋白IgY是大分子量蛋白，分子量约为15×105 Da，等电点为5．4—5．5．由于其分 子量较大，以聚丙烯酰胺为等电聚焦电泳载体无法将其区分．而改用琼脂糖凝胶作为等电点电泳的分离载体，使传统上用聚丙烯酰胺为等电聚焦电泳载体无法分离的大分子蛋白(M，>100 kDa，如鸡卵黄免疫球蛋白(IgV))的点在双向电泳图上得到了确认，说明以琼脂糖为载体可以分离100 kDa以上的蛋白质，这是因为琼脂糖凝胶孔径比聚丙烯酰胺大．电泳效果见图5．参考文献：
[1] Kortt Michael A，Bootman J Lyle．Phytotherapy in treatment of benign prostatic hyperphsia：a critical review[J]．Cl／nical Thempeutics，
1996，18(6)：1 227—1 241．
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[4] Eli Lilly，Company．LY 191701：type 1 steroid5a—reductase inhibitor treatment ofandrogenic alopecia[J]．DrIlgs Fut，1995，20
(2)：144—147．
[5] 孙祖越，吴建辉，屠曾宏．一个简捷的甾体5a一还原酶抑制剂体外筛选模型[J]．上海实验动物科学，2002，22(4)：
204—2O8．
[6] 孙祖越，郑维君，王晓麟，等．甾体5a一还原酶活性的新测定方法[J]．中华内分泌代谢杂志，1998，14(3)：2O6—
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[7] 董晓燕．生物化学实验[M]．北京：化学工业出版社，2003．
[8] 崔毓桂，张桂元．正常成年男性5a一还原酶活性的测定[J]．生殖医学杂志，1995，4(1)：11—15．
【9J lmperato—McGinley J，Sanchez R S，Sponger J R，et ．Coml~ son ofthe e~ects ofthe 5 alph —reductsse inhibitorfinasteride
and the antiandrogen thtamide on prostate and genital diferentiation：dose—response studies[J]．Endecrinology，1992，131(3)
