合成简介
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种， 主要是由ABI/PE 公司生产。合成的原理基本相同，主要差别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时的不同。信利来公司采用的合成仪主要机型为ABI394长链合成仪和美国biosearch公司产的板式高通量192道合成仪。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3‘端向5‘端合成，相邻的核苷酸通过3‘→5‘磷酸二酯键连接。
第一步，三氯乙酸和预先连接在固相载体（CPG）上的核苷酸反应（其活性基团处于被保护状态），脱去核苷酸5‘-羟基的保护基团DMT，获得游离的5‘-羟基；
第二步，合成DNA的原料（亚磷酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3‘端被活化，5‘-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5‘-羟基发生缩合反应；
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5‘-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉；
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5‘-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，测定OD260定量。
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