ChIP-seq等揭示转录因子通过表观遗传调控保护核糖体发生与稳定性
胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）在核糖体RNA（rRNA）基因位点表现出高活性染色质状态，这一状态不仅参与rRNA转录活性和核糖体发生（ribosome biogenesis, RiBi），还与基因组结构组织密切相关。然而ESCs中这种活性染色质状态如何维持尚未阐明。
2026年8月25日，中国科学院昆明动物研究所郑萍研究员/王林副研究员和中国科学院上海药物研究所周虎研究员合作，在《PLOS Biology》期刊发表题为“Tcf15 promotes an open nucleolar chromatin state to safeguard ribosome biogenesis and genome stability in mouse embryonic stem cells”的科研成果，揭示了转录因子Tcf15在小鼠胚胎干细胞（ESCs）中的新功能。转录因子Tcf15作为核仁特异性调节因子，通过独立招募两种表观遗传修饰因子（Tet2和Rbbp5）到核糖体DNA（rDNA）编码区，维持rDNA的开放染色质状态。
在野生型小鼠胚胎干细胞中，Tcf15招募Tet2或Rbbp5以激活rDNA染色质。Tcf15-Rbbp5和Tcf15-Tet2复合体发挥不同的生物学功能。Tcf15-Rbbp5轴中，Tcf15促进rRNA转录和核糖体发生、参与DNA复制和DNA损伤修复基因的选择性翻译，从而保护基因组稳定性。而Tcf15-Tet2轴则可能参与基因组结构组织。
研究方法
（1）ChIP-seq/ChIP-qPCR：ChIP-seq在全基因组范围内定位Tcf15、EZH2、SUZ12等蛋白在染色质上的结合位点，确认Tcf15在rDNA编码区（18S和28S）的富集。ChIP-qPCR验证Tcf15结合及PRC2核心亚基EZH2、SUZ12在Tcf15-KD后于rDNA的异常富集。
（2）CUT&Tag：绘制H3K27me3等组蛋白修饰在rDNA区域的分布图谱。
（3）WGBS：在全基因组水平上单碱基分辨率地分析DNA甲基化水平，从而检测Tcf15敲低后rDNA区域CpG甲基化。
（4）蛋白质互作鉴定：在活细胞中鉴定Tcf15的邻近互作蛋白，成功鉴定出Tet2和Rbbp5。
（5）Ribo-seq+RNA-seq：全面分析Tcf15敲低后转录组和翻译组的整体变化，揭示Tcf15对特定mRNA亚群翻译效率的调控。
（6）功能验证实验：免疫共沉淀 (Co-IP)、免疫荧光、western blot、多聚核糖体分析、DNA纤维实验、中性彗星实验、核糖体分析。
结果图形
（1）Tcf15在小鼠ESCs中定位于核仁并结合rRNA基因编码区
- 免疫荧光染色显示Flag-Tcf15（绿色）在ESCs中与核仁标志物FBL（红色）和NPM1（红色）共定位。
- 亚细胞分级分离和免疫印迹分析显示核仁中的Tcf15。
- ChIP-seq基因组轨迹图显示，Tcf15结合于rRNA基因的18S和28S编码区。
- ChIP-qPCR验证Tcf15与rRNA基因18S和28S区域的结合。
- 免疫荧光染色显示Tcf15敲低（KD）使核仁内H3K27me3水平升高。
- Western blot分析对照(KDC)、Tcf15-KD1和Tcf15-KD2 ESCs核仁的H3K4me3和H3K27me3水平变化。
- 核仁DNA斑点杂交分析显示Tcf15 KD ESCs的DNA m5C甲基化水平高于KDC细胞。
- KDC和Tcf15-KD ESCs中rDNA区域（chrR）上的H3K27me3修饰分布图谱。
- KDC和Tcf15-KD ESCs中rRNA基因区域H3K27me3的peaks谱。
- ChIP-qPCR分析显示，Tcf15-KD ESCs中PRC2核心亚基EZH2在rDNA区域的结合增加。
- ChIP-qPCR分析显示，Tcf15-KD ESCs中PRC2核心亚基SUZ12在rDNA区域的结合增加。
- KDC与Tcf15-KD ESCs之间差异DNA甲基化的rDNA区域。
- qPCR验证KDC和Tcf15-KD ESCs中rDNA的CpG甲基化水平。
- 免疫沉淀和质谱鉴定Tcf15互作蛋白火山图分析。
- 相互免疫沉淀及免疫印迹在纯化核仁中验证Tcf15与Tet2或Rbbp5的互作。
- Tet2(红色)和Tcf15(绿色)的免疫荧光染色显示部分共定位。
- Rbbp5(红色)和Tcf15(绿色)的免疫荧光染色显示部分共定位。
E-F. ChIP-qPCR分析显示,Tcf15敲低显著降低Tet2和Rbbp5与18S和28SrDNA区域的结合。
G. 核仁DNA的斑点杂交分析显示,Tet2敲低ESC的DNA m5C甲基化水平高于KDC细胞。
H-I. Tet2敲低(H)或Rbbp5敲低(I)在核仁内降低H3K4me3水平及增加H3K27me3修饰。
（4）Tcf15-Rbbp5复合体保护rRNA转录活性、核糖体发生和新生蛋白合成
- qRT-PCR检测Tcf15 KDC和KD ESCs中pre-47S、成熟28S、18S和5.8S rRNA的相对水平。
- 与KDC相比，Tcf15 KD ESCs中核糖体亚基(40S和60S)、单核糖体(80S)和多聚核糖体的含量均降低。C. Tcf15 KDC和KD ESCs中O-丙炔基-嘌呤霉素（OPP）的绿色荧光标记情况。
D. 流式细胞术分析Tcf15KDC和KD胚胎干细胞中OPP绿色荧光标记情况。
E. qRT-PCR检测Tet2 KD和KDC ESCs中pre-47S、成熟28S、18S和5.8SrRNA的相对水平。
F. 与KDC相比，Tet2 KD ESCs中核糖体亚基(40S和60S)、单核糖体(80S)和多聚核糖体丰度无显著变化。G. qRT-PCR检测Rbbp5 KD和KDC ESCs中pre-47S、成熟28S、18S和5.8SrRNA的相对水平。
H. 与KDC相比，Rbbp5 KD ESCs中核糖体亚基(40S和60S)、单核糖体(80S)和多聚核糖体丰度发生显著变化。
（5）Tcf15缺失选择性抑制部分ESC富集蛋白翻译
- 对ESC中受Tcf15敲低影响的翻译相关基因进行的火山图分析。
- GO富集分析揭示在Tcf15敲低ESC中翻译效率下降的基因所富集的生物学过程。
- GO富集分析揭示在Tcf15敲低ESC中翻译效率升高的基因所富集的生物学过程。
- ESC富集蛋白与在Tcf15敲低ESC中翻译下降的蛋白之间的重叠分析韦恩图。
- 对(D)中重叠的181个蛋白进行GO富集分析。
F-H. 与KDC相比,Tcf15敲降ESC中代表性蛋白的表达下降免疫印迹验证。
- western blot分析Tcf15 KDC和KD ESCs中Chk1的激活情况。
- DNA纤维实验显示，在羟基脲（HU）处理下，Tcf15KD胚胎干细胞中停滞复制叉的恢复能力显著受损。
- DNA纤维实验测量KDC和Tcf15 KD ESCs中的复制叉起始情况。
- 连续培养6天期间Tcf15 KD和KDC ESCs的细胞计数。
- western blot分析Tcf15 KDC和KD ESCs中Chk2的激活情况。
- ESCs用10μM依托泊苷处理2小时并恢复。中性彗星实验显示Tcf15 KD ESCs的修复效率受损。
本研究通过ChIP-seq、CUT&Tag、WGBS、Ribo-seq、RNA-seq等多组学整合分析，揭示了Tcf15作为ESCs特异性核仁因子，通过Tcf15-Rbbp5和Tcf15-Tet2双轴机制维持rDNA的活性染色质状态。其中Tcf15-Rbbp5轴对rRNA转录和核糖体发生至关重要，并进一步通过翻译调控保护DNA复制和修复蛋白合成，从而保护基因组稳定性。
该研究将核仁染色质调控、核糖体发生与基因组稳定性的维持直接联系起来，为理解干细胞生物学及核糖体相关疾病提供了新的理论基础。ChIP-seq、CUT&Tag、WGBS与Ribo-seq的整合，为解析重复序列富集的rDNA区表观图谱及其功能提供了方法学参考。
参考文献：
Dong YP, Chen YM, Tang M, Zhou H, Wang L, Zheng P. Tcf15 promotes an open nucleolar chromatin state to safeguard ribosome biogenesis and genome stability in mouse embryonic stem cells. PLoS Biol. 2026 Aug;24(8):e3003954.doi: 10.1371/journal.pbio.3003954.
