细胞总乙酰化水平的快速测定方法

 细胞总乙酰化水平的快速测定方法 -------免疫亲和色谱-ELISA方法

步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白

1.用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm离心2分钟，取上清备用。
2.取20-40 μL抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388)， 用PBS洗2次，每次1mL。
3.将细胞裂解上清液与洗好的填料（ICP0388）混匀，39oC旋转摇床低速孵育60分钟。
4.1000rpm离心1分钟，去上清，用PBSt重悬沉淀，1000rpm离心1分钟，去上清，重复3次，最后一次用PBS洗，吸弃上清。
注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。

步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白                                    
5.用20 μL0.1M HCL将步骤2的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2分钟，10000rpm离心1分钟，将上清液体全部转移到含有80 μL的0.2M Na2CO3的ELISA薄板上，39oC孵育30分钟；
6.取出ELISA薄板，拍干。用PBSt清洗2次，每次均需拍干。加入100 μL含0.5%BSA的PBSt ，39 ℃封闭10分钟。


步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记物检测蛋白乙酰化水平

7.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗2次，拍干。加入100 μL浓度为0.25 μg/mL抗赖氨酸抗体HRP偶联复合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381），39 ℃孵育30分钟。
8.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗板孔3次，每次均需拍干。加入100 μLTMB液，39 ℃孵育显色10-20分钟。最后加入100 μL 0.1 M H₂SO₄终止反应，在450nm波长下读数。 

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