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最后更新:2009-9-15半年访问:54
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蛋白提取技术服务
收集蛋白样品(Protein sample preparation)
1.常用蛋白裂解液:
● 组织裂解液(全细胞蛋白提取)
1) Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4
2) Nacl 150 mmoL/L
3) 脱氧胆酸钠 0.25%
4) NP-40或1%TritonX-100
5) EDTA 1 mmoL/L
6) PMSF 1 mmoL/L
7) Aprotinin 1μg/ml
8) Leupeptin 1μg/ml
9) Pepstain 1μg/ml
其中:7,8,9作用不持久,要使用前加入。

● 细胞裂解液
NP-40裂解体系:
1)150 mmoL/L Nacl
2) 1.0%NP-40或TritonX-100
3) 50 mmoL/L Tris(PH8.0)

● RIPA裂解体系
1) 150 mmoL/L Nacl
2) 1.0%NP-40或TritonX-100
3) 0.5%脱氧胆酸钠 A
4) 0.1%SDS
5) 50 mmoL/L Tris( ph8.0)

2. 蛋白提取程序:
● 培养细胞样品处理方法:
培养动物组织细胞由于没有细胞壁,因此可以将细胞收集下来,直接加入裂解缓冲液(Lysis buffer)抽提总蛋白。
总蛋白抽提程序:
(1) 培养细胞的收集;
(2) 用磷酸缓冲液(PBS)洗细胞3 次(室温,1000g, 各2min);
(3) 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中,吸干残留的PBS;
(4) 加入裂解缓冲液(1.5x106 个细胞大约加入100μL 裂解液),4℃超声20min,使其充分溶解

(5) 4℃,12,000g,离心20min;
(6) 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白,然后分装至Eppendorf 管里,保存在-75℃ 备用。

● 动物组织超速离心法: 
(1)取材;
(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品(动物组织)研成粉末,每1g 样品加入0.5ml 裂解液, 室温反应30min;
(3)4℃,15 000×g离心25 min;
(4)取离心上清。Brandford 法定量,分装后置-75℃保存。
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