C端测序

——即质谱法蛋白质N/C端氨基酸序列分析技术服务

蛋白质样品的N/C末端序列分析，对于医药工业来说是非常重要的信息。目前N末端序列分析大多采取Edman降解法，但Edman降解法不能解决N端封闭和蛋白质修饰的测序问题，而质谱法测序则不受限制。蛋白质的C末端分析，并不能采取类似N端氨基酸序列分析的化学分析。无论是国内要求，还是国外药典，现阶段都是采取质谱法对蛋白质样品的C末端序列分析。20世纪80年代末发展的基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）使质谱技术在蛋白质结构分析上的应用发生了革命性飞跃。肽段在质谱中的碎裂有一定规律，通常最容易断裂的是肽键位置，得到分别命名为b离子和y离子的M/Z图谱，分析图谱得到蛋白质的N/C端序列。

“Edman降解法并不能解决所有的蛋白质氨基酸序列测定问题。”

电喷雾电离（ESI）质谱可以对蛋白质或者多肽样品的N/C端氨基酸序列进行鉴定。APT为客户进行N/C端氨基酸序列分析的仪器为LTQ-Velos，这是一种双压线性离子阱质谱，在定量和定性分析方面都具有优势。由于高传输离子透镜和快速扫描双压阱，LTQ-Velos显著提高了碎裂能力，将碎裂时间缩短，同时提高质谱分辨率。LTQ-Velos可以与液相色谱兼容，并同时快速分析大量蛋白质成分。

技术指标

■  蛋白质酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用LTQ-Velos质谱仪（Thermo Finnigan, San Jose, CA）进行质谱分析。

    进样方式：Microspray；

    毛细管温度：200℃；

    检测方式：正离子；

    多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集20个碎片图谱（MS2 scan）。

■  LTQ-Velos 产生的原始数据由Bioworks 3.3 软件查库，搜索使用的数据库为根据样品理论序列建立的蛋白库，数据筛选参数为：Xcorr≥1.9 (Charge 1)， Xcorr≥2.2 (Charge 2)，Xcorr≥3.75 (Charge 3)。

案例分析

抗体类蛋白质样品的N/C端氨基酸序列分析

其中Trypsin酶解后的样品经过LC-MS/MS分析后，得到和理论C端序列（************）相符合的MS2图谱，此MS2图谱为2电荷离子，Xcorr得分为3.3，超过可信标准的要求（Xcorr≥2.2），图谱如下：

质谱法C端氨基酸序列测定的图谱（实例），b、y离子匹配图谱

Q&A

尽管Edman法技术已近乎完善，但仍有不尽人意之处，例如Edman降解法不能解决N端封闭的测序问题（环化、封闭）、被修饰的蛋白不能给出确切的信号，要求蛋白或多肽的纯度在95%以上，灵敏度较低。质谱法不受N末端封闭的限制，能对侧链基团翻译后加工或化学修饰进行定位，灵敏度很高，因而具有其独特优势，与传统的Edman降解法相互补。

抗体类蛋白质药物分子重链C末端赖氨酸会有不同程度的缺失现象发生，质量控制中需要建立对这类现象的定性和定量分析方法。C端赖氨酸（K）缺失后，会造成供试品酶解后C末端多肽分子的序列发生变化，并且这两种C末端多肽分子（缺失或者不缺失K）的定量结果可以反映蛋白质分子C端赖氨酸的缺失程度。

APT在合成供试品理论C端多肽分子和缺失赖氨酸C端多肽分子的基础上，使用外标法建立起对供试品C端赖氨酸缺失程度的定性定量方法。