LncRNA过表达和抑制

LncRNA 简介

     长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200nt的长链非编码RNA分子，是RNA聚合酶II转录的副产物，它可在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达。据统计，哺乳动物蛋白编码基因占总RNA的1%，长链非编码RNA占总RNA的比例可达4%-9%，这些长链非编码RNA是基因功能研究的又一座宝库。

     目前发现的许多lncRNA都具有保守的二级结构，一定的剪切形式以及亚细胞定位。它们在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以分为5种：、正义链（sense）、反义链（antisense）、双向（bidirectional）、内含子间（intronic）、基因间（intergenic），其所在的位置与其功能有一定的相关性。

LncRNA的作用机制

LncRNA的作用机制比较复杂，可能通过多种机制发挥作用，目前发现的lncRNA的作用机制包括：

1)在蛋白编码基因上游启动子区发生转录，干扰下游基因的转录表达；

2)抑制RNA聚合酶II活性、介导染色质重构或组蛋白修饰等，影响相关基因表达；

3)与蛋白编码基因的mRNA结合，干扰mRNA的剪切成熟过程；

4)与蛋白编码基因的mR N A结合，在D i c e r酶作用下产生内源性的siRNA，从而调控相关基因的表达；

5)lncRNA还可结合到特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；

6)通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的胞质定位。

总体说来，lncRNA通过表观遗传学调控、转录调控、转录后调控、蛋白活性调控等多种方式调控相关基因的作用。

LncRNA的研究方法

1)生物信息学分析；

2)表达检测：特异性qRT-PCR表达检测；

3)功能研究：特异性针对lncRNA的RNA干扰；外源过表达分析；表达谱芯片分析lncRNA功能。

研究LncRNA相关需要注意一下问题：

1、 lncRNA大部分都是定位于细胞核内，具有高度二级结构的RNA，与DNA、蛋白相互结合形成复合体，阻止了siRNA与lncRNA的结合效率。

2、 lncRNA在很多细胞类型或者模型中表达丰度很低，所以在进行RNAi干扰之前建议进行基因的基础表达水平的检测，做到干扰前后心中有数。

3、 lncRNA很多表达丰度很低，由于lncRNA目前检检测方法在RNA本身，所以一定确保PCR反应体系稳定性，重复性和可信度，筛选时候用SYBR染料法，在条件允许情况下使用taqman探针法进行检测。

4、 并非所有lncRNA是可以得到好的干扰效果的。如果当你在阳性对照得到了80-90%抑制效率，lncRNA设计了5-8条序列都没有好的干扰效率，那么lncRNA很难被干扰，可能与RNA结构和相关作用蛋白以及作用通路的机理有关，建议使用其他的方式进行抑制。

5、 RNA反转录试剂尽量使用随机引物或者特异性进行逆转录，很多lncRNA没有polyA。

6、 细胞核中的lncRNA，最好用ASO（反义核酸）进行Knock down。

7、 一般推荐设计3-5条siRNA,选择1-2条最高效的序列进行后续试验。

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