核心特点
高特异性:引物针对保守区设计,避免与其他微生物交叉反应。
高灵敏度:检测下限为10~100拷贝/μL,支持5个数量级的定量线性范围。
便捷性:预混优化试剂,即开即用,仅需提供DNA模板。
质控保障:含无传染性DNA片段作为阳性对照,区分假阴性结果。
适用范围:
科研用途,适用于灰马杜拉分枝菌DNA的定性或荧光定量PCR检测。
使用方法
样本准备
DNA提取:建议使用兼容的病毒DNA提取试剂盒(如柱式法),试剂盒可能附带裂解液试用装。
标准曲线制备(定量检测时需操作):
将阳性对照(1×10^8拷贝/μL)按10倍梯度稀释至6个浓度(10^2~10^7拷贝/μL),独立操作避免污染。
稀释液为配套荧光PCR模板稀释液。
PCR反应体系
反应条件:
扩增程序需根据引物特性设定,常规包括预变性(95℃)、变性-退火-延伸循环(30~40次)。
推荐扩增片段长度200~500bp,引物浓度0.1~1 μmol/L。
注意事项
操作分区:核酸提取、试剂配制、扩增需在独立区域进行,防止交叉污染。
试剂解冻:使用前需完全解冻并离心混匀。
引物设计原则:
长度20bp左右,GC含量40%~60%,避免二级结构及3'端互补。
质量控制与结果解读
阳性对照:确认试剂有效性及扩增条件优化。
阴性对照:排除试剂或环境污染。
定量分析:通过标准曲线计算样本中靶DNA拷贝数。
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