药物杂质分析解决方案--离子阱多级液质

 

 

 

药物杂质因其可能对药品质量、安全性和有效性产生影响，目前成为国内外药品监管机构的重点关注内容之一。随着我国医药产品出口规模的扩大，了解国外法规市场的药物杂质控制要求、加强对药物杂质的分析与控制已成为国内药品生产企业共同关注的话题。

 

任何影响药物纯度的物质统称为杂质，人用药物注册技术要求国际协调会（简称ICH）对杂质的定义为药物中存在的，化学结构与该药物不一致的任何成分。药物中含有杂质会降低疗效，影响药物的稳定性，有的甚至对人体健康有害或产生其他毒副作用。因此，检测有关物质，控制纯度对确保用药安全有效，对保证药物质量非常重要。

 

杂质谱分析是指研究药物中存在的已知和未知的杂质的分布情况，分析药物中杂质的来源和去向，通过杂质谱的研究，可以全面的评估药物的安全性。对于药物生产阶段，杂质谱研究可以在工艺过程中建立完整可靠的杂质分析方法，对工艺的关键步骤监控杂质的变化情况，验证杂质分析方法并转移到QA/QC，对于药物研发阶段，需要对艺研发过程中的杂质进行鉴定和表征并进一步确认杂质的来源，研发人员根据分析结果可以评价药物的安全性和与原研药的一致性，并根据杂质来源进一步优化工艺，降低或消除杂质的产生。

 

有机杂质主要起源于起始原料及其本身所含杂质、生产过程中带入的合成中间体与副反应产物、成品在储存过程中产生的降解产物，辅料带入的杂质或辅料相互作用降解产生的杂质，及药物与包材相互作用产生的杂质。有机杂质在成品药物中含量通常很低，制备纯化需要消耗大量人力物力，常规分析方法难以应对多组分、低含量的杂质结构解析工作。离子阱质谱仪，因其灵敏的MSn 能力，复杂样品的高通量常规分析，高质量的结构信息，快速正负离子切换技术，快速正负离子切换技术，稳定、可靠、便于操作，被广泛的应用于药物杂质研究，临床和法医鉴定，天然化合物鉴定，代谢物鉴定等领域。

 

 

药物中的杂质往往含量很小，在大量的母药存在下，检测到微量的杂质是对质谱技术的一大挑战，采集到杂质的质谱信息后，对这些工艺杂质或降解产物的结构进行有效的解析是另一大挑战。Thermo 的离子阱技术有效地解决了以上杂质研究难题，其高灵敏度和宽广的动态范围能够采集到微量杂质的有效质谱信息，离子阱的多级质谱能力和强大的解析软件可以对杂质结构进行深入的剖析，同时结合色谱高效的分离能力和专业的结构解析软件，Thermo 建立了专门针对杂质分析的解决方案。

 

 

图1. 基于离子阱的杂质解析流程

 

 

离子阱是时间串联的质谱技术，化合物离子的捕获，隔离，激发和抛射都在阱中完成，正因如此，离子阱重复此扫描过程即可完成多级碎裂（MSⁿ）。

 

 

图2. 离子阱时间串联扫描

 

离子阱中的稳定区域可以通过马绍方程计算出来，化合物离子在特定的射频电压下按照特定频率移动，增加RF 电压， 离子的频率（q 值）将会增加，逐渐提高射频, 使离子从低m/z 到高m/z 逐渐依次离开，完成扫描。

 

 

图3. 离子阱扫描原理

 

作为离子阱质谱的领导者，Thermo 专利的线性离子阱提供最快的速度同时保证优异的灵敏度

● 离子沿着中心线方向聚集，同时也减少了空间电荷效应，极大提高离子容量；

● 双径向检测器设计同时检测离子，离子检测速度更快，响应强度更高，信号更加稳定；

● 离子捕获效率更高，获得更高的灵敏度，进行更多级数的碎裂；

 

● 最大序列覆盖率，源自卓越的循环时间和灵敏度

● 自动MSn 触发数据依赖中性丢失扫描

● 灵活的离子化模式、进样口和色谱解决方案

 

● 优异的离子统计学使定量稳定可靠

● 碰撞能量归一化获得最高工作效率

● 为规范实验室提供同时定性和定量数据

 

● 持久稳定性适应复杂基质样品可靠定量

● 正、负离子模式下同时定量和定性

● 简便地操作提高实验室效率

 

● 出色的MSn 谱图质量和全扫描采集技术

● 低浓度代谢物结构确认，无需了解MRM 信息

● 数据依赖和动态排除技术可以从复杂样品中获得最多信息

 

 

Thermo 离子阱提供丰富的采样模式，既有通用模板帮助快速建立分析方法，又有拓展功能满足深入分析的需要。

 

 

注：Zoom 扫描是通过降低扫描速度增加分辨率的一种离子阱扫描方式

 

杂质研究过程中通常需要对药物中的已知或目标杂质进行分析，离子阱的选择反应监测（SRM）可对杂质特定的母离子和子离子进行扫描，保证结果的特异性和准确性，连续反应监测（CRM）更可对杂质特定的母离子，子离子和多级离子进行扫描，获得更高的灵敏度和抗干扰能力。下图中采用SRM 对目标化合物的母离子m/z 258 和子离子进行扫描，可看到在2.65min 有一明显色谱峰，在采用CRM 进一步对目标化合物的三级离子m/z 133 进行扫描后，2.65min 的化合物背景干扰明显降低，信噪比有了大幅提升。

 

 

图4. 多级质谱提供更高的特异性与灵敏度

 

未知杂质的鉴定是杂质研究工作中非常重要的一部分内容，因为结构未知，如何采集到准确的杂质母离子和多级质谱信息成为结构解析的前提和关键。数据关联多级质谱及动态扫描功能可以实现对未知杂质信号的采集。

 

如下图所示，离子阱通过一级扫描，获得化合物质谱信息，根据质谱响应强弱自动选择母离子进行多级质谱扫描，一次进样即可获得杂质多级质谱信息。

 

 

图5. 数据关联扫描同时采集已知与未知杂质

 

在采用数据关联扫描对洛哌丁胺药物的分析中，离子阱通过全扫获得一级质谱信号，然后对响应最强的洛哌丁胺母离子进行二级碎裂，然后自动选则m/z 266 和m/z 210 两个主要二级离子进行三级碎裂，紧接着对由二级离子m/z 266 产生的三级离子m/z 210 和m/z 238 进行四级碎裂。数据关联扫描可以在一次进样内，即自动完成多级质谱过程，无需预先知道样品中的化合物信息，提高了分析通量和数据信息量。

 

 

图6. 数据关联扫描采集洛哌丁胺多级质谱数据

 

动态排除功能：在药物杂质研究中，常涉及到从液相方法到液质方法的转移过程，而液质方法因为流动相与液相不同，往往无法在短时间内将所有杂质分离，离子阱具有动态排除功能，开启后可以对所有共流出杂质进行多级碎裂，以应对色谱未完全将杂质分离的情况。

 

在下图中，化合物m/z 452和m/z 407发生了共流出，开启动态排除后，仪器首先对响应较高的m/z 407进行二级碎裂，然后将m/z 407 放入排除列表，在下一次全扫中，响应较高的m/z 407 即作为排除项，转而选择响应较弱的m/z 452 进行二级碎裂。所以在一个色谱峰内，即使有多个化合物存在，动态排除都能保证采集到每个化合物的多级质谱信号。

 

 

图7. 动态排除采集共流出杂质组分

 

 

杂质的种类繁多，即使是相同元素组成的化合物，结构也可能完全不同，所以需要对采集到的数据进行有效的解析，对推测的结构式进行判断，Mass FrontierTM为质谱谱图的管理、评估和解析提供精密的特性。它可广泛应用于小分子结构鉴定，应用范围涉及包括药物开发、杂质的分析和毒理研究过程中代谢产物的识别等广阔领域。

 

 

图8. Mass Frontier结构解析软件

 

使用Massfrontier，研究人员可以方便的从已采集的数据中获取以下信息：

 

● 化合物的裂解机理

因为杂质的结构和母药的结构往往类似或者具有渊源，所以了解母药的裂解规律可以帮助判断杂质的碎片结构，进一步推测出杂质的结构。

 

以前的方法仅仅依靠研究者的个人经验，或者纯理论的计算，使得数据分析的重现性和准确性受到了限制。

 

 

图9. 传统结构解析方法

 

Mass Frontier 所含有的Fragmentation LibraryTM 碎裂机理谱图库是从现存的所有关于质谱的出版物中收集而来，几乎涵盖了所有已发表的文献。每一种机理，连同其化学结构，都经过人工和自动核对，然后连同标题、作者及信息来源等附带信息一块储存于谱图库中。谱图库所收集的信息，加上通用的电离、碎裂和重组规则，为碎裂机理的预测提供了有力的保障。Mass Frontier 还可以允许用户创建基于客户自定义碎裂机理上的谱图库，并能学会并运用这些机理来智能预测碎片分子。

 

 

图10. Fragmentation Library根据已发表文献提供霉酚酸酯杂质裂解机理

 

● 有关物质的检获

一些杂质组分会因为信号响应太低，或者形成的色谱峰不够尖锐，而被研究人员忽略，但是含量很低的毒性杂质严重的影响药物安全性，漏检不仅会极大的影响用药的安全性，也会间接影响到新药申报。

 

MassFrontier 的Fragment Ion Search (FISh) 可通过过滤无论是由理论裂解预测还是由实验MSn 质谱谱树获得的一组裂解碎片可对结构相似化合物进行快速筛选，通过杂质与母药的碎片比对查找，精确的找出所有有关杂质。

 

 

图11. Fragment Ion Search (FISh)检索霉酚酸酯痕量杂质

 

线性离子阱多种解离技术对阿德福韦酯杂质谱的全面鉴定