小鼠左肺原位注射细胞操作SOP

这一篇是整套系列的"主刀手册"。不堆术语，只讲每个动作为什么这么做、做到什么程度算到位、哪里最容易出错。照着走一遍，比看十篇综述都管用。

取对数期细胞，胰酶消化、含血清培养基中和，离心后用预冷的25%基质胶／PBS重悬到目标浓度，全程冰上。

抽15到25微升进微量注射器。针头先用冰PBS润洗一遍——这一步是防止基质胶在室温针头里提前凝固堵针。

到位标准：细胞是均匀单细胞悬液，注射器里没有气泡，针头不挂胶。

异氟烷诱导后，把小鼠右侧卧位固定（这样暴露的是左侧胸壁），鼻锥维持麻醉。左胸壁去毛约2.5厘米见方（裸鼠可跳过），涂眼膏。

碘伏从中心向外环形消毒，70%乙醇脱碘，交替三遍。再夹一次脚趾确认麻醉深度。

用镊子把皮肤轻轻提起（别直接戳到胸壁），在左肩胛骨下缘约0.5厘米、沿左侧胸壁中线切一个约1厘米的横切口。

再逐层分开皮下脂肪和筋膜，避开看得见的血管，用弯止血钳钝性撑开，让肋骨和肋间隙露出来。这时候透过胸壁应该能看到一片随呼吸起伏的淡粉色——那就是左肺。

关键纪律：到这里都不要穿透胸壁。看到肺在动，就说明暴露到位了。

这是决定成败的四秒钟，拆成四个要点：

找位置：数切口里最下方那根肋（约第8肋），往头侧数到第5到6肋间——这个水平左肺最宽最厚，最好扎。

角度和深度：注射器与胸壁表面垂直（90度），在第6肋上缘进针，深度4到5毫米（用你事先做的刻度标记控制）。

推注：缓慢推。针进到肺实质里时，通常能看到肺局部微微鼓起——这证明细胞真的打进了肺里，而不是漏进了胸腔。

退针：推完留针2到3秒再缓慢拔出来，减少细胞顺着针道往外漏。

打完这一下，小鼠呼吸、心率会一过性加快，这是正常反应，应该在1到2分钟内自己平复。如果急促一直不缓过来，要警惕是不是扎成了气胸。

对齐皮下和皮肤，用2到3个伤口夹闭合，术区用无菌PBS擦干净。

立刻腹腔注射镇痛：Ketoprofen 5毫克／千克（或Buprenorphine 0.1毫克／千克），术后24小时可再补一次。

然后把小鼠切口朝下、左侧卧位放进温暖的笼子，单笼等它从麻醉里彻底醒过来，再合笼。

术后10到14天，麻醉后用拆夹器把伤口夹拆掉，等鼠苏醒即可。

每打一只，都用70%乙醇把注射器和器械彻底擦一遍，防止动物之间交叉污染。

· 进针后肺没鼓起、小鼠却立刻呼吸困难——很可能扎进了胸腔而不是肺实质，或者造成了气胸。

· 推注很顺但最后成像信号散在胸腔——多半是拔针太快、细胞漏了。

· 几只鼠成瘤、几只不成——回头查是不是细胞悬液放久了、或者中途忘了重新混匀。

照着这六个动作走，剩下的变量就交给细胞本身的成瘤特性——这也是为什么下一篇我们要专门讲怎么验证、怎么动态监测。