利用HiFi测序解析面肩肱型肌营养不良症(FSHD)致病的D4Z4重复序列

对于罹患面肩肱型肌营养不良症（FSHD）的家系而言，该病最让人难以承受的一点，就是无法预知后续病情发展。FSHD是成人中较为常见的遗传性肌营养不良症之一，典型表现为面部、肩部及上臂肌肉进行性无力。但即便携带相似遗传变异的患者，病程表现也可能天差地别：有的人终身无明显症状，有的人肌力会逐步衰退，最终需要借助轮椅。这种不可预测性给患病家系的生活规划带来极大困难，也让研究人员一直困惑：为何该疾病的个体差异如此巨大。

在分子层面，FSHD的发病机制是染色质松弛，以及骨骼肌中DUX4基因异常表达。以往解析该区域通常需要多项独立实验联合检测。

在近期一篇预印本论文中，PacBio的研究人员联合GeneDx以及莱顿大学医学中心，介绍了一款全新计算工具Kivvi，用于攻克上述难题。该工具已发布于GitHub平台，可基于HiFi长读长测序数据解析FSHD重复序列。研究中，Kivvi与传统方法进行对比测试，成功检出所有致病等位基因。这一结果证明，一套HiFi测序流程即可替代多项独立检测，同时也能支撑人群规模研究，助力挖掘新的遗传修饰因子。

亨廷顿病等重复扩增疾病的特点是DNA重复区域扩增，拷贝数大幅超出安全阈值¹，与之不同，绝大多数FSHD病例的致病原因是携带DUX4基因的D4Z4重复区域发生拷贝数缩减。正常人群通常携带11～100个D4Z4拷贝（每个拷贝长 3.3 kb）；而1型FSHD患者的D4Z4拷贝数仅为1～10 个。

图 1（Xie et al. 2024）²：两种 FSHD 亚型的分子机制概述

这类情况占全部FSHD病例的 95%：该重复区域发生拷贝数缩减后，抑制DUX4表达的染色质结构被松解，DUX4 得以激活。而FSHD2通常与SMCHD1等染色质调控因子的变异相关，这类变异会造成D4Z4区域甲基化水平全局性下降。由于D4Z4序列存在于4号、10号两条不同染色体上，且不同等位基因的功能表现各不相同，因此解析 FSHD需要同时明确重复序列长度、来源染色体、单倍型以及甲基化状态。

传统检测流程一次只能获取部分信息。脉冲场凝胶电泳（PFGE）结合Southern印迹法长期用于测定D4Z4长度，但该方法操作繁琐、通量低。光学基因组图谱（OGM）是近年出现的替代方案，不过它对DNA提取的时间窗口要求极高，且大多仅适用于血液样本。实验室往往需要攒够样本批量上机。同时OGM无法检测甲基化或序列水平变异，因此通常还要搭配亚硫酸氢盐测序，以及对FSHD2相关基因单独测序。

表1. FSHD遗传特征检测方法汇总：传统检测方案与HiFi全基因组测序联合Kivvi工具对比

结合Kivvi工具的HiFi长读长测序

与上述传统方法不同，长读长测序可在单次检测中同时获得重复序列长度、序列信息以及甲基化数据。基于HiFi全基因组测序读段，Kivvi工具抓取覆盖D4Z4的读段，依靠细微的序列差异区分各个重复单元；再利用每条高精度HiFi read跨越多重连续单元的特点，拼接组装得到完整等位基因。

针对每一个D4Z4等位基因，Kivvi可输出以下结果：

• 重复序列长度：FSHD1核心检测指标
• 来源染色体：区分致病性4q等位基因与同源10q等位基因
• 等位基因类型：包含4qA多聚腺苷酸化信号是否完整或被破坏
• 甲基化水平：直接从同一份HiFi reads中天然识别 5mC，无需亚硫酸氢盐转化

研究团队利用千人基因组计划27例对照样本的Southern印迹结果、以及GeneDx完成表征的10例FSHD1样本的光学图谱（OGM）结果，将Kivvi与前述传统方法进行性能比对。在两组数据集里，Kivvi检出全部11个缩短型等位基因，并对90%的非缩短型等位基因完成正确分型。

图1c（Chen 等人，2026）³：Kivvi对D4Z4等位基因的组装结果。该图由 Kivvi 生成，每个子图上方展示一条等位基因，下方为支持该等位基因的测序读段。每条等位基因上标注了各重复单元的边界。信息位点以不同颜色绘制：黄色代表参考序列、黑色代表变异位点、粉色代表缺失或不一致信息、蓝绿色代表侧翼序列。本示例样本（HG02071）共组装出 4 个等位基因（从上至下）：10qA（5 个拷贝）、10qA（7 个拷贝）、4qA（8 个拷贝）以及 4qB（10 个拷贝）。

表2. Kivvi性能验证结果，对照Southern印迹与OGM，（Chen et al., 2026）

甲基化信息提供了另一层关键研判依据。研究团队除了FSHD1样本外，还利用DeepVariant在同一套HiFi全基因组测序数据中，分析了另外6例携带SMCHD1变异的FSHD2相关样本。FSHD1样本中，甲基化降低仅局限于缩短型等位基因；而携带FSHD2相关SMCHD1致病变异的样本，几乎所有D4Z4等位基因都呈现甲基化水平下降。Kivvi可输出该特征图谱，有助于区分FSHD1和FSHD2患者。

上述结果基于血液样本获得，但HiFi全基因组测序也可采用唾液样本：已有成熟方案可从唾液中提取高分子量DNA，并完成约30×测序深度的HiFi WGS。

Kivvi 能为您带来什么

临床及参比实验室
可采用标准化HiFi全基因组测序搭配开源分析工具，替代原有的多方法联合FSHD检测流程。一次测序即可获得重复序列长度、单倍型、甲基化以及FSHD相关基因变异；这份数据还可同时用于其他罕见病的分析。

科研人员与罕见病机构
对临床确诊但遗传病因不明的病例进行解析；结合甲基化信息研究临界等位基因。依托人群规模数据，挖掘遗传修饰因子，解释FSHD在家系内表型差异巨大的原因。

药企与生物技术公司
基于同一套数据，结合重复长度、单倍型、序列变异、甲基化信息，更精准地划定临床试验队列。甲基化可作为潜在分层标志物；统一检测流程也便于多试验中心开展检测。

人群规模测序与 FSHD 研究展望

研究人员还利用Kivvi对5个祖先人群共601例样本的D4Z4进行图谱解析，发现了常见单倍型、嵌合重复单元以及带有易位痕迹的等位基因；其中非洲裔人群的序列多样性更高。这种大规模的完整序列数据，为后续研究奠定基础，有助于发掘遗传修饰因子，进而解释为何FSHD在同一家族不同成员间的发病表现差异巨大。

这种更完整的分子图谱，也可为药企和生物技术公司开展 FSHD药物研发提供支撑。依托单次HiFi测序数据即可解析D4Z4重复结构、单倍型、序列变异与甲基化信息，Kivvi能够帮助研究者更精准地表征FSHD受试人群、挖掘潜在疾病修饰因子，并为治疗研究与临床试验划定更精准的受试队列。

FSHD2与SMCHD1、DNMT3B、LRIF1基因变异相关⁴。LRIF1相关变异也被归类为独立的双基因遗传亚型FSHD3，该分型体系仍在不断完善⁵,⁶。这类患者的D4Z4重复长度通常正常，因此仅依靠重复长度检测往往会漏检。由于HiFi全基因组测序可在同一套数据中同时获取D4Z4甲基化和上述基因的变异信息，实验室无需追加二次检测、也不需要重新采集样本，即可开展FSHD2与FSHD3的分析。

研究团队还在拓展Kivvi，用于其他具有类似长重复单元、具备临床意义的重复序列区域。Kivvi目前已支持LPA基因中的Kringle IV-2型（KIV-2）重复序列分析，该区域拷贝数与心血管疾病风险相关⁴。

综上，上述研究成果预示着未来：仅需一套HiFi全基因组测序数据，就能同时检测重复长度、单倍型、甲基化及序列变异，大幅简化FSHD研究，为解析基因组中这一高度复杂区域开辟全新研究方向。

参考文献：

1. Chen, Z., Morris, H. R., Polke, J., Wood, N. W., Gandhi, S., Ryten, M., Houlden, H., & Tucci, A. (2025). Repeat expansion disorders. Practical Neurology, 25(3), 204-216. https://pn.bmj.com/content/25/3/204
2. Xie, Q., Ma, G., & Song, Y. (2024). Therapeutic strategy and clinical path of facioscapulohumeral muscular dystrophy: review of the current literature. Applied Sciences, 14(18), 8222. https://doi.org/10.3390/app14188222
3. Chen, X., et al. (2026). Resolution of the D4Z4 repeat responsible for facioscapulohumeral muscular dystrophy with HiFi sequencing. bioRxiv, 2026-04. https://doi.org/10.64898/2026.04.10.717730
4. Facioscapulohumeral muscular dystrophy type 2: an update on the clinical, genetic, and molecular findings. (2021). Neuromuscular Disorders. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2021.09.010
5. OMIM #619477. Facioscapulohumeral muscular dystrophy 3, digenic; FSHD3. https://omim.org/entry/619477
6. Hamanaka, K., et al. (2020). Homozygous nonsense variant in LRIF1 associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000009617

关于PacBio

PacBio（纳斯达克股票代码：PACB）是一家领先的生命科学技术企业，专注于设计、研发及生产前沿测序解决方案，助力科研人员与临床研究者攻克各类复杂的遗传学难题。公司旗下产品与技术（包括 HiFi 长读长测序技术）可广泛应用于多个研究领域，涵盖人类生殖系测序、动植物科学、感染病与微生物学、肿瘤学以及其他新兴研究方向。欲了解更多信息，请访问www.pacbio.cn。

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