3T3-L1是源自Swiss小鼠胚胎成纤维细胞、经克隆筛选获得的前脂肪细胞系，呈成纤维细胞形态、贴壁生长。细胞达到接触抑制后，采用胰岛素、地塞米松、IBMX组成的激素诱导剂，可分化为成熟脂肪细胞，能够合成并蓄积甘油三酯、表达胰岛素受体，是研究脂肪分化调控机制、肥胖与糖尿病病理、胰岛素信号通路及降糖药物筛选的经典主流模型。该细胞培养存在关键特点：扩增阶段需使用新生牛血清/小牛血清，且严禁高密度长满；若细胞汇合过度，其分化能力会发生不可逆衰减。本文将系统梳理3T3-L1扩增培养与诱导分化的完整操作流程。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制扩增培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%新生牛血清（abs978-500mL/SH30401.07）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴轻柔摇晃融化，约2min；融化期间保持管盖与O型圈在水面之上，减少污染风险。
3.【重悬】内容物融化后立即取出，70%乙醇擦拭或浸洗消毒外壁，此后全程严格无菌操作；将细胞悬液转入含9.0mL完全培养基的离心管中。
4.【离心】约125×g离心5-7min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入5-6mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养，复苏后24h换液。
注意：3T3-L1扩增阶段的标准血清推荐使用新生牛血清/小牛血清，不推荐胎牛血清，因FBS会加速增殖、易导致细胞过度生长和分化，影响后续成脂诱导实验，且不建议热灭活。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制扩增培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%新生牛血清（abs978-500mL/SH30401.07）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）与0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜紫外照射30min。
2.【镜检】传代时机与其他细胞不同：汇合度达到70%-80%之前必须传代，或活细胞密度达5×10⁴-6×10⁴个/cm²时传代；绝不允许让培养瓶长满。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，用D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）轻轻润洗细胞层1次，去除残留血清；沿瓶壁加入，避免直接冲刷细胞面。
4.【细胞消化】加入2-3mL胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）溶液覆盖瓶底，室温或37℃静置，镜下观察至细胞层分散，通常5-15min；难脱落的细胞可置于37℃促进分散。
注意：等待细胞脱落期间切勿敲击或摇晃培养瓶，否则细胞成团脱落、聚团；成团的3T3-L1后续分化会明显不均。
5.【终止与收集】加入6-8mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落并分散为单细胞悬液。
6.【离心】1000rpm离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻重悬。
7.【传代】按推荐接种密度2×10³-3×10³个/cm²接种至新瓶（相当于约1:4-1:6），补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
8.【镜检】镜下确认分散均匀后放入37℃、5%CO₂培养箱；换液每2-3天一次。
注意：若计划做分化实验，代次越高分化能力越差，建议使用低代次细胞（复苏后不超过5-8代）并固定代次窗口。
三、脂肪细胞诱导分化
1.【接种】取汇合度70%-80%的细胞消化计数，按6孔板8×10⁴个/孔、24孔板2×10⁴个/孔、96孔板2×10³个/孔接种于扩增完全培养基。
2.【长满】培养48h至100%汇合；换液一次，再维持汇合状态48h（即接种后第4天进入诱导）。
3.【诱导】吸弃扩增培养基，立即换入分化培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）+1μM 地塞米松（abs42016673-1g）+0.5mM IBMX（abs817348-10mg）+1μg/mL 胰岛素（abs42019847-100mg），诱导48h。
注意：吸净旧液后应立即加入分化培养基，细胞干燥会显著脱落。
4.【维持】48h后换入维持培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）+1μg/mL胰岛素（abs42019847-100mg），此后每48-72h换液一次。
5.【观察】诱导后7-15天细胞完全分化，镜下可见折光性脂滴；油红O或尼罗红染色验证。此阶段细胞贴壁变松、极易脱落，换液必须轻柔沿壁加入。
注意：分化培养基的pH须在7.0-7.4、渗透压270-365 mOsm/kg，超出范围会导致细胞成片脱落；分化失败的最常见原因是细胞未长满即诱导或诱导时已过度汇合老化。
四、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：完全培养基+5%（v/v）DMSO（abs9187-100mL）；如使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）可省去程序降温步骤。冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】取对数生长期、汇合度70%左右的细胞（切勿取已长满的细胞冻存），消化收集，离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约2-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮气相长期保存。注意：-70℃存放会导致活力丧失，不可长期置于-80℃。
注意：建议在收到细胞后先冻存一管低代次种子，一周后复苏检查活力，确认冻存体系合适后再批量冻存。
四、关键注意事项
1.血清选择（最重要的一条）
（1）扩增阶段标准配方为DMEM高糖+10%新生牛血清/小牛血清，且不建议热灭活；
（2）新生牛血清/小牛血清不可随意用胎牛血清替代——血清类型直接影响脂质积累与分化潜能；国内不少实验室长期用FBS扩增，若必须沿用，需先做一次分化对照验证分化能力未受影响；
（3）分化与维持阶段使用DMEM高糖+10%FBS，与扩增阶段的血清体系不同，不要混用。
2.汇合度管理
（1）扩增阶段不允许长满—3T3-L1进入接触抑制后，部分细胞开始向脂肪样转化，分化同步性被破坏；
（2）传代红线：汇合度70%-80%之前，或活细胞密度5×10⁴-6×10⁴个/cm²；
（3）冻存同样取70%汇合的细胞，长满后冻存的细胞复苏后分化能力下降。
3.分化失败的常见原因
（1）细胞未达到100%汇合即加诱导剂，或诱导时细胞已老化；
（2）血清问题：分化阶段FBS批次不适，或扩增阶段误用FBS破坏了分化潜能；
（3）试剂失效：IBMX、地塞米松、胰岛素工作液应分装冻存、避免反复冻融；
（4）诱导后换液动作过猛——分化阶段起细胞贴壁变松，沿壁缓慢加液。
4.形态与阶段判断
（1）扩增期：成纤维细胞样、梭形、旋涡状排列，胞体清亮无脂滴；
（2）诱导后2-3天：细胞变圆、折光性增强，开始出现小脂滴；
（3）分化成熟（7-15天）：细胞内充满大脂滴，呈戒指状排列；油红O染色阳性为判定标准。
5.代次与质控
（1）代次是分化实验成败的第一变量，建议固定种子细胞代次与使用代次上限（一般不超过P10，分化实验用低代次）；
（2）建议定期STR/同工酶鉴定，注意与NIH/3T3区分——两者同为Swiss小鼠胚胎来源，名字相近；
（3）定期支原体检测；支原体感染会显著抑制分化，脂滴形成减少常是支原体的第一个提示。
参考资料
ATCC
