MEF（Mouse Embryonic Fibroblasts，小鼠胚胎成纤维细胞）分离自孕鼠 E12.5-E14.5胚胎躯干组织，细胞呈细长梭形、贴壁生长，为有限传代原代细胞，P2-P5是最佳使用区间，传代超过该范围后增殖能力逐步下降、发生衰老。MEF有两大经典应用方向：其一，经辐照或丝裂霉素C灭活后，用作ES/iPS等干细胞的饲养层细胞；其二，作为研究细胞衰老、DNA损伤、氧化应激、iPS重编程及基因功能的模式细胞。MEF对培养密度高度敏感，接种过疏易提前衰老，汇合度过高也会加速老化，培养可参照3T3体系规律传代；本文将梳理MEF扩增培养标准化流程。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴轻柔摇晃融化，约2min；融化期间保持管盖与O型圈在水面之上，减少污染风险。
3.【重悬】内容物融化后立即取出，70%乙醇擦拭或浸洗消毒外壁，此后全程严格无菌操作；将细胞悬液转入含9.0mL完全培养基的离心管中。
4.【离心】约200×g离心5min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T75培养瓶（加入12-15mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。MEF复苏后需要尽快恢复接触密度，不建议接种过稀。
6.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养，复苏后24h换液。
注意：MEF接种过稀会提前衰老，因此一支冻存管复苏后建议接入T75或10cm细胞培养皿，保证1-2天内即可铺展成片。
二、细胞传代（3T3方案）
1.【实验准备】配制完全培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）与0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜紫外照射30min。
2.【镜检】汇合度达70%-85%时传代，禁止长满至100%（接触抑制会启动衰老程序）；细胞呈细长梭形、旋涡状排列。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，用D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）轻轻润洗细胞层1次，去除残留血清；沿瓶壁加入，避免直接冲刷细胞面。
4.【细胞消化】加入胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）溶液覆盖瓶底（T75约3mL），37℃消化约2-3min，镜下见细胞回缩变圆、间隙变大即终止。
注意：等待细胞脱落期间切勿敲击或摇晃培养瓶，否则细胞成团脱落；MEF成团后铺板不均，密度窗口随即失控。
5.【终止与收集】加入完全培养基终止消化，轻轻吹打为单细胞悬液，计数。
6.【离心】约200×g离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻重悬。
7.【传代】按1:3-1:6的比例传代，每3天按3×10⁵个/60mm细胞培养皿（约1.2×10⁶个/10cm细胞培养皿）传代一次。固定节奏传代可最大化延缓衰老窗口。
8.【镜检】镜下确认分散均匀后放入培养箱；换液每2-3天一次。
注意：每代都应记录代次（P值）；P5以后细胞增殖明显放缓，关键实验应在P2-P5窗口内完成；P0-P2大量冻存建立种子库。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：90% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL），现用现配；如使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）可省去程序降温步骤。冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】取对数生长期、汇合度70%-85%的细胞，按传代步骤消化收集，离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1×10⁶-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮气相长期保存。注意：-70℃存放会导致活力丧失，不可长期置于-80℃。
注意：原代MEF每代都很宝贵，P0-P2应大量冻存建立种子库，之后所有使用都从种子库逐级扩增。
四、关键注意事项
1.培养基与血清
（1）标准配方为DMEM高糖 + 10% FBS，可补加L-谷氨酰胺（abs9354-100ml）与非必需氨基酸（NEAA）（SH30238.01）；
（2）MEF对血清质量敏感，建议固定批号并使用优级胎牛血清（abs972-500mL/SV30302.03）；血清批次更换会改变生长速率，进而影响代次窗口的判断；
（3）低氧培养（3% O2）可显著延缓MEF衰老——常氧（21% O2）下小鼠成纤维细胞的衰老本质是氧化应激；有条件的实验室建议使用三气培养箱。
2.密度窗口（该细胞的核心）
（1）过疏提前衰老、过满提前老化—MEF需要适度接触才能维持生长态，但长满即触发接触抑制与衰老；
（2）传代红线：汇合度70%-85%；推荐1:3-1:6或按3T3方案固定细胞数、固定节奏传代；
（3）若细胞过大、变扁、铺展失去梭形，即为衰老表现，不可再用—衰老细胞会分泌SASP因子，干扰共培养与共接种实验。
3.代次管理（决定实验成败）
（1）P2-P5为黄金窗口；P6及以后不建议用于正式实验；
（2）P0（原代收获后第一次汇合）与P1-P2应大量冻存建立种子库，此后逐级扩增；
（3）P9以后增殖明显放缓并走向衰老危机；极少数逃逸克隆会自发永生化并出现核型异常，此类细胞已非原代MEF，不可混用；
（4）每瓶细胞务必标注代次与日期，实验报告中注明所用代次。
4.用途相关提醒
（1）作为ES/iPS饲养层使用时，须经γ射线或丝裂霉素C灭活——具体流程参见本系列「ICR小鼠胚胎成纤维细胞（经射线处理）」专篇，此处不再重复；
（2）作为重编程（iPS）起始细胞时，使用低代次MEF并保证诱导时处于对数生长期；
（3）作为衰老模型时，可用传代衰老或应激诱导，注意区分衰老与老化（密度失控导致的假性老化）。
5.形态与污染判断
（1）正常：细长梭形、旋涡状排列、折光性好、胞质清亮；
（2）异常：细胞变扁变大、失去梭形——衰老或老化；成团不铺展——消化过度或接种过稀；
（3）异常：培养基浑浊、pH骤降——提示污染，须立即隔离处理。
6.质控
（1）原代MEF为自备细胞时，每批制备都应做支原体检测（取上清静置培养5天后检测）；
（2）商品化MEF注意品系信息（ICR、C57BL/6、BALB/c等），饲养层用途需与目标干细胞品系匹配；
（3）建议定期镜检拍照建立本实验室的MEF形态基线，便于代次与状态的横向比较。
