B16-F10是小鼠皮肤黑色素瘤细胞经典高转移亚系，源自C57BL/6J小鼠，经体内筛选获得肺高转移表型。细胞呈上皮样至梭形、贴壁生长，可合成并分泌黑色素。该细胞与C57BL/6J同源，可在免疫系统完整小鼠体内成瘤，皮下接种及尾静脉肺转移模型成熟，广泛用于转移机制、抗转移药物、肿瘤免疫治疗及纳米递药研究，并表达gp100、TRP-2等抗原。该细胞在DMEM中易出现黑色素快速沉积，培养中需重点把控基础培养基的选择与传代密度，本文将针对B16-F10的细胞培养流程进行梳理和指导。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：RPMI 1640（abs9484-500mL/SV30306.01）+10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴轻柔摇晃融化，约2min；融化期间保持管盖与O型圈在水面之上，减少污染风险。
3.【重悬】内容物融化后立即取出，70%乙醇擦拭或浸洗消毒外壁，此后全程严格无菌操作；将细胞悬液转入含9.0mL完全培养基的离心管中。
4.【离心】约125×g离心5-7min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入5-6mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养，复苏后24h换液。
注意：培养基中见棕黑色颗粒或培养液颜色发黑，多为黑色素沉积，属正常现象，不是污染，不必丢弃。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：RPMI 1640（abs9484-500mL/SV30306.01）+10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）与0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜紫外照射30min。以下体积以T75瓶为准，其他规格按比例增减。
2.【镜检】汇合度达80%-90%时即可传代；细胞呈上皮样至梭形，可见黑色素颗粒；倍增时间约24-36小时，通常2-3天长满。维持细胞密度在1×10⁴-2.3×10⁵个/cm²之间。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，用D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）轻轻润洗细胞层1次，去除残留血清（血清含胰酶抑制剂）；沿瓶壁加入，避免直接冲刷细胞面。
4.【细胞消化】加入2-3mL胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）溶液覆盖瓶底，室温或37℃静置，镜下观察至细胞层分散，通常5-15min；难脱落的细胞可置于37℃促进分散。
注意：等待细胞脱落期间切勿敲击或摇晃培养瓶，否则细胞成团脱落、聚团，影响铺板均匀度与后续计数。
5.【终止与收集】加入6-8mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落并分散为单细胞悬液；吹打轻柔，避免产生过多气泡。
6.【离心】1000rpm离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻重悬。
7.【传代】按1:10的比例接种至新瓶（推荐接种密度2×10⁴-4×10⁴个/cm²；国内多数实验室按1:3-1:4常规传代，同样可用），补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
8.【镜检】镜下确认分散均匀后放入37℃、5%CO₂培养箱；换液每2-3天一次。
注意：接种后前24h尽量少移动培养瓶；B16消化后重新贴壁需数小时，过早移动会形成密度不均的岛状克隆。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：完全培养基+5%（v/v）DMSO（abs9187-100mL）；如使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）可省去程序降温步骤。冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】取对数生长期、汇合度70%-80%的细胞，按传代步骤消化收集，离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约2-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮气相长期保存。注意：-70℃存放会导致活力丧失，不可长期置于-80℃。
四、关键注意事项
1.基础培养基与黑色素沉积
（1）标准配方为RPMI-1640 + 10% FBS，扩增与冻存的基准体系；
（2）改用DMEM培养时黑色素会快速积累，细胞可能停止增殖甚至死亡，常规扩增与冻存务必使用RPMI-1640；如需做黑色素合成分泌相关实验，应先将细胞扩增冻存后再换DMEM，且提前评估细胞耐受；
（3）培养液出现棕黑色或细胞内黑色颗粒为黑色素沉积，属正常现象，与污染的鉴别要点是培养基浑浊度与pH变化——污染时培养基明显浑浊且pH骤降。
2.传代密度与状态维持
（1）该细胞生长快、代谢旺盛，不可让培养瓶长期过满，否则黑色素大量沉积、细胞状态迅速下滑；
（2）推荐维持密度1×10⁴-2.3×10⁵个/cm²，传代按1:10（推荐）或1:3-1:4（国内常用）执行；
（3）消化通常5-15min，以镜下细胞层分散为准；B16整体消化顺畅，若明显拖长多为细胞老化或血清问题。
3.体内实验相关提醒
（1）B16-F10与C57BL/6J小鼠同源，是免疫系统完整小鼠荷瘤模型的首选，皮下接种用于成瘤与药效评价，尾静脉接种用于肺转移模型；
（2）接种用细胞须处于对数生长期、状态良好，消化后充分洗涤去除血清与胰酶，并使用无血清培养基或PBS重悬；
（3）该细胞具有致瘤性，操作时做好个人防护，废弃物按规范灭活处理。
4.形态与污染判断
（1）正常：上皮样至梭形，贴壁成片，可见黑色素颗粒；倍增时间约24-36小时；
（2）异常：细胞变圆漂浮增多、颗粒不再沉积——多为消化过度、密度过高或血清批次不适；
（3）异常：培养基浑浊、pH骤降——提示污染，须立即隔离处理。
5.代次与质控
（1）高转移表型随代次增加可能出现漂移，动物实验建议使用低代次细胞并固定代次窗口；
（2）建议定期STR或同工酶鉴定，B16系列亚系（B16-F0/F1/F10）之间易混淆，须明确标注所用亚系；
（3）定期支原体检测——支原体会显著改变该细胞的转移与免疫相关表型，直接影响体内实验结果。
参考资料
ATCC
