依靠短读序列间接获取长距离基因组信息存在的固有局限

在过去约15年间，业界多次尝试改造短读长测序技术，以获取长距离基因组信息，其中包括10X Genomics的Linked Reads、Illumina TruSeq合成长读长，以及Illumina Infinity Reads（后续更名为Illumina Complete Long Reads）。与同期PacBio数据对比后发现，上述每一种方案均存在大量错误与缺陷，最终这些技术均已停止使用。

近期，Illumina推出了该思路的新一代方案 —— 名为TruPath Genome的全基因组测序（WGS）方法，并发布了经过充分表征的HG002 “瓶中基因组” 基准真实人类样本数据，同时附带基于DRAGEN泛基因组的比对结果和变异检出数据。因此我们再次审视这类新型数据，并对比同一样本的PacBio HiFi全基因组测序数据（该数据同样公开）。初步的四点观察显示，TruPath数据存在与前述技术相似的错误，这反映出从短读序列获取长距离基因组信息本身就存在固有局限。

1. 部分标准Illumina测序无法检出的变异，在TruPath数据中依然缺失。
2. TruPath会检出无reads支持的变异。
3. TruPath检出的部分变异，其reads支持信息存在矛盾。
4. TruPath数据不包含甲基化信息。

下文将针对每一类问题各列举一个代表性示例。

1）部分标准Illumina测序无法检出的变异，在TruPath数据中依然漏检。

下文给出TruPath基因组漏检变异的实例：NPIPB3基因属于高度多态、灵长类特有基因家族，该家族与免疫应答相关。HiFi读段可正确检出并完成分型（定相）3个缺失变异：等位基因1上的87 bp缺失与252 bp缺失，以及等位基因2上的126 bp缺失。与之相反，所有 TruPath reads均未检出上述缺失（标准Illumina测序同样无法检出，此处未展示）。

2）TruPath 会检出无reads支撑的变异。

与漏检情况相反，TruPath基因组存在一类现象：在没有任何比对reads作为证据的情况下，仍然检出变异。如下例所示，FMR1基因上的 (CGG)n 重复序列长度，对个体罹患脆性X相关疾病的风险至关重要。相较于GRCh38参考基因组，HiFi reads准确检出多出11个重复单元（33 bp插入变异）；该变异属于健康范围。HG002样本为男性，因此仅有一条X染色体等位基因。

与之相反，TruPath数据中没有任何一条比对reads检出该插入变异。即便如此，DRAGEN 泛基因组辅助分析流程依然推断出了这个33 bp插入变异。

3）TruPath检出的部分变异，其reads支撑信息存在矛盾。

在部分案例中，TruPath测序reads结果与泛基因组辅助推断结论相互冲突，进而产生错误的变异检出。下图展示了NCS1基因的一个内含子区域，该基因与神经发育疾病相关。HiFi reads可直接完成变异检出与单体型定相：分别存在368 bp和129 bp的杂合插入，后续还有一个单碱基A的杂合缺失；该缺失与368 bp插入位于同一等位单体型上，这一结果同样与基准真值集保持一致。

与之相反，TruPath基因组分析将该区域同时检出为8 bp杂合缺失和129 bp纯合插入，这两个结果均是错误的。此外，368 bp杂合插入以及单碱基A缺失这两处变异被漏检。

再者，从底层相互矛盾的读段支撑信息来看，TruPath给出的变异检出结果令人费解。第一，覆盖该区域的48条已比对TruPath reads中，有45条存在7 bp或8 bp缺失错误；尽管几乎全部reads（94%）都带有该缺失，算法却将此8 bp缺失判定为杂合。第二，仅有3条reads包含129 bp插入，且reads质量很差（2条比对质量值为0，1条比对质量值为3；仅1条reads完成定相）。即便支撑证据的检出频次低、质量差，该129 bp插入依然被检出，并在变异文件中被错误标记为纯合。

4）TruPath数据不包含甲基化信息。

甲基化胞嘧啶是基因调控、衰老过程的关键决定因素，且与多种疾病相关。每次HiFi全基因组测序可直接输出全基因组范围内5-甲基胞嘧啶（5mC）位点信息，并能在IGV中可视化（右键菜单：Color alignments by > base modification (5mC)）。下图展示印记基因 PEG10（该基因对哺乳动物胎盘发育至关重要，同时也是多种癌症的致癌驱动因子）；在HiFi reads中，CpG环境下红色代表5mC，蓝色代表未甲基化胞嘧啶。该结果可区分基因起始区域两条等位基因间的甲基化状态差异，并将这种差异甲基化与邻近杂合单核苷酸变异、插入缺失以及一处74 bp内含子缺失完成单体型定相。

TruPath基因组数据不提供5mC相关信息。因此，在IGV中开启甲基化可视化功能后，不会显示任何染色信息，无法识别等位基因印记、甲基化覆盖范围以及差异甲基化的单体型定相（TruPath同样未能检出该74 bp缺失）。

综上可见，TruPath数据依然存在与前代技术类似的错误，这反映出依靠短读序列间接获取长距离基因组信息存在固有局限。泛基因组参考是一项重要进展（顺带一提，泛基因组本身就是基于HiFi数据构建的），但TruPath基因组与PacBio HiFi全基因组测序对泛基因组的使用方式截然不同，举例如下：

HiFi全基因组测序：“HiFi reads相对于hg38检出了一个未知变异。泛基因组显示该变异在多个人群中属于常见变异，因此其致病概率较低。” 

TruPath基因组：“相对于hg38，TruPath没有reads证据，或reads证据相互矛盾；但该变异在泛基因组中为常见变异，因此推断样本中同样存在该变异。”

借助泛基因组间接推断变异，在解析以下场景的根本病因时存在偏倚与错误风险：罕见遗传病（这类变异天然区别于泛基因组序列）、个体新发变异、肿瘤体细胞变异与结构重排、低频人群特异性变异等。尽管TruPath基因组的全基因组基准统计指标看似有所提升，但对于真实样本中无reads支撑或reads证据矛盾的稀有、个体化变异，该结果未必可靠。与之相反，HiFi全基因组测序直接测定二倍体人类基因组的遗传与表观遗传变异，以此为基础结合泛基因组开展解读与研究。

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