FUNCAT-PLA技术在实现神经元新生DBN蛋白原位可视化追踪中的应用
在神经科学和细胞生物学研究中，理解特定蛋白质的合成、定位与降解的动态过程，对于揭示其生理功能至关重要。传统方法如Western blot虽能检测蛋白总量，却无法提供单细胞乃至亚细胞结构（如 dendritic spines）的空间信息。
荧光非天然氨基酸标记-邻位连接技术（Fluorescent Non-canonical Amino Acid Tagging combined with Proximity Ligation Assay, FUNCAT-PLA） 的出现，为这一难题提供了强大的解决方案。该技术巧妙结合了非天然氨基酸AHA的代谢标记与高灵敏度的PLA信号放大，使得我们能够原位、可视化地追踪内源性新生蛋白。在一项关于Drebrin（DBN）蛋白的研究中，FUNCAT-PLA展示了其独特的应用价值。
1，研究背景
Drebrin (DBN) 是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，富集于神经元树突棘，参与调控突触可塑性。其表达水平下降与衰老及阿尔茨海默病相关的认知缺陷有关。然而，DBN蛋白在神经元中的稳定性如何，以及其合成与降解的动态过程，此前尚不清晰。为了解答这一问题，研究者引入了FUNCAT-PLA技术。
2，FUNCAT-PLA应用与关键结果
2.1 捕捉DBN蛋白的“新生”合成
研究者首先利用FUNCAT-PLA技术，在大鼠原代海马神经元中可视化新合成的DBN蛋白。
在MAP2阳性的树突及树突棘附近，检测到了大量代表新生DBN蛋白的FUNCAT-PLA信号（图3a）。表明，DBN蛋白可以在神经元远端区域进行局部翻译。为了证明信号的特异性，研究者设置了严格的对照组：
AHA + Anisomycin组-在AHA标记期间加入蛋白质合成抑制剂茴香霉素（Anisomycin），PLA信号几乎消失。
Methionine对照组-用天然氨基酸甲硫氨酸（Methionine） 替代AHA进行脉冲标记，同样检测不到PLA信号。（图3b）。
这些对照实验有力地证明了，FUNCAT-PLA信号真实地反映了新合成的DBN蛋白。
2.2 测定DBN蛋白的原位“寿命”（半衰期）
FUNCAT-PLA不仅可以“拍下”蛋白合成的瞬间，还能通过“脉冲-追踪”（Pulse-Chase）实验，追踪新生蛋白的降解过程，从而测定其原位半衰期。
对神经元进行2小时的AHA脉冲标记后，更换为不含AHA的培养基进行不同时间的“追踪”（Chase），随后进行FUNCAT-PLA检测（图3a）。
定量分析显示，DBN的FUNCAT-PLA信号在追踪过程中逐渐衰减（图3c）。在68小时的追踪后，约50%的初始信号消失，表明DBN蛋白在原位的半衰期约为68小时。这一结果与通过生化方法测得的半衰期高度一致，验证了FUNCAT-PLA用于研究内源性蛋白降解动力学的可靠性。
图3. 使用 FUNCAT-PLA 可视化神经元内源性 DBN 的周转a. 实验流程示意图。海马神经元与 AHA 共孵育，随后更换为不含 AHA 的培养基进行“追踪”，再进行 FUNCAT 点击化学反应。通过 DBN 免疫染色和随后的原位邻位连接技术（PLA），可实现新合成 DBN 的可视化。b. FUNCAT-PLA 实验方案的验证。在仅含 AHA（AHA）、AHA 加茴香霉素（AHA-anisomycin）或仅含甲硫氨酸（Met control）的条件下，新生 DBN 的荧光信号（FUNCAT-PLA，品红色）显示。定量结果为 FUNCAT-PLA 信号与细胞体积标志物（MAP2）面积的比值，并以 AHA 处理组为参照进行归一化。AHA 组：n = 53，N = 5；AHA + 茴香霉素组：n = 14，N = 3；甲硫氨酸对照组：n = 32，N = 5。
经 2 小时 AHA 脉冲标记后（0 小时追踪），再分别追踪 24 小时或 68 小时的新合成 DBN 信号。定量结果为 FUNCAT-PLA 信号与 MAP2 面积的比值，并以“追踪 0 小时”时间点为参照进行归一化。0 小时追踪组：n = 42，N = 3；24 小时追踪组：n = 40，N = 3；68 小时追踪组：n = 44，N = 3。所有柱状图数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计学分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA）Bonferroni 检验。***p < 0.001。N 表示生物学独立实验次数，n 表示分析的神经元总数。DBN：发育调控脑蛋白；ANOVA：方差分析
3，实验流程（FUNCAT-PLA）
细胞准备与饥饿处理
大鼠原代海马神经元，体外培养 17~24 天（DIV 17-24）。
饥饿处理：吸去原有培养基，更换为不含甲硫氨酸（Methionine-free）的 Neurobasal A 培养基（补充 1% Glutamax 和 2% B27）。此步骤的目的是耗尽细胞内源性的甲硫氨酸，提高后续AHA的掺入效率。
细胞培养与代谢标记（脉冲）：
加入4 mM AHA（叠氮高丙氨酸） 进行2小时的脉冲标记，使新合成的蛋白掺入AHA。
固定与透化：
用PBS-MC缓冲液洗涤细胞。使用含4% PFA（多聚甲醛）和4%蔗糖的PBS-MC固定细胞20分钟。用0.5% Triton X-100进行透化处理15分钟。用4%山羊血清封闭1小时。
点击化学反应（Click Chemistry）：
使用Click-iT® Protein Reaction Buffer Kit，进行生物素-炔烃（Biotin-alkyne） 的点击化学反应。该步骤通过共价键将生物素标签连接到含有AHA的新生蛋白上。
邻位连接技术（PLA）：
使用抗生物素（anti-biotin）抗体和抗DBN抗体（一抗）共同孵育细胞。随后加入对应的PLA抗体探针，行连接与滚环扩增反应，产生可被荧光探针检测到的信号。
复染与成像：
用MAP2抗体标记树突，Hoechst标记细胞核。使用共聚焦显微镜（如Leica TCS SP8）采集Z-stack图像。使用Fiji（ImageJ） 软件及特定插件进行半自动化定量分析。
统计与MAP2信号重叠或在其附近（<1 µm）的PLA点（puncta），并将其总数除以MAP2标记的树突面积进行归一化，以消除细胞大小差异带来的影响。
4，总结与展望
FUNCAT-PLA技术通过在单细胞水平上实现新生蛋白的“可视化”，为研究蛋白质的动态生命史——从合成、运输到降解——提供了前所未有的时空分辨率。
在该研究中，FUNCAT-PLA不仅证实了DBN蛋白在神经元树突中的局部合成，更精确测定了其长达68小时的原位半衰期。这些发现为理解DBN蛋白在氧化应激下的稳定性调控机制提供了直接证据。FUNCAT-PLA技术正成为神经科学、细胞生物学等领域研究蛋白质动态与功能关联的利器。
小优推荐：
荧光非天然氨基酸标记-邻位连接技术（Fluorescent Non-canonical Amino Acid Tagging combined with Proximity Ligation Assay, FUNCAT-PLA） 的出现，为这一难题提供了强大的解决方案。该技术巧妙结合了非天然氨基酸AHA的代谢标记与高灵敏度的PLA信号放大，使得我们能够原位、可视化地追踪内源性新生蛋白。在一项关于Drebrin（DBN）蛋白的研究中，FUNCAT-PLA展示了其独特的应用价值。
1，研究背景
Drebrin (DBN) 是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，富集于神经元树突棘，参与调控突触可塑性。其表达水平下降与衰老及阿尔茨海默病相关的认知缺陷有关。然而，DBN蛋白在神经元中的稳定性如何，以及其合成与降解的动态过程，此前尚不清晰。为了解答这一问题，研究者引入了FUNCAT-PLA技术。
2，FUNCAT-PLA应用与关键结果
2.1 捕捉DBN蛋白的“新生”合成
研究者首先利用FUNCAT-PLA技术，在大鼠原代海马神经元中可视化新合成的DBN蛋白。
在MAP2阳性的树突及树突棘附近，检测到了大量代表新生DBN蛋白的FUNCAT-PLA信号（图3a）。表明，DBN蛋白可以在神经元远端区域进行局部翻译。为了证明信号的特异性，研究者设置了严格的对照组：
AHA + Anisomycin组-在AHA标记期间加入蛋白质合成抑制剂茴香霉素（Anisomycin），PLA信号几乎消失。
Methionine对照组-用天然氨基酸甲硫氨酸（Methionine） 替代AHA进行脉冲标记，同样检测不到PLA信号。（图3b）。
这些对照实验有力地证明了，FUNCAT-PLA信号真实地反映了新合成的DBN蛋白。
2.2 测定DBN蛋白的原位“寿命”（半衰期）
FUNCAT-PLA不仅可以“拍下”蛋白合成的瞬间，还能通过“脉冲-追踪”（Pulse-Chase）实验，追踪新生蛋白的降解过程，从而测定其原位半衰期。
对神经元进行2小时的AHA脉冲标记后，更换为不含AHA的培养基进行不同时间的“追踪”（Chase），随后进行FUNCAT-PLA检测（图3a）。
定量分析显示，DBN的FUNCAT-PLA信号在追踪过程中逐渐衰减（图3c）。在68小时的追踪后，约50%的初始信号消失，表明DBN蛋白在原位的半衰期约为68小时。这一结果与通过生化方法测得的半衰期高度一致，验证了FUNCAT-PLA用于研究内源性蛋白降解动力学的可靠性。
经 2 小时 AHA 脉冲标记后（0 小时追踪），再分别追踪 24 小时或 68 小时的新合成 DBN 信号。定量结果为 FUNCAT-PLA 信号与 MAP2 面积的比值，并以“追踪 0 小时”时间点为参照进行归一化。0 小时追踪组：n = 42，N = 3；24 小时追踪组：n = 40，N = 3；68 小时追踪组：n = 44，N = 3。所有柱状图数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计学分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA）Bonferroni 检验。***p < 0.001。N 表示生物学独立实验次数，n 表示分析的神经元总数。DBN：发育调控脑蛋白；ANOVA：方差分析
3，实验流程（FUNCAT-PLA）
细胞准备与饥饿处理
大鼠原代海马神经元，体外培养 17~24 天（DIV 17-24）。
饥饿处理：吸去原有培养基，更换为不含甲硫氨酸（Methionine-free）的 Neurobasal A 培养基（补充 1% Glutamax 和 2% B27）。此步骤的目的是耗尽细胞内源性的甲硫氨酸，提高后续AHA的掺入效率。
细胞培养与代谢标记（脉冲）：
加入4 mM AHA（叠氮高丙氨酸） 进行2小时的脉冲标记，使新合成的蛋白掺入AHA。
固定与透化：
用PBS-MC缓冲液洗涤细胞。使用含4% PFA（多聚甲醛）和4%蔗糖的PBS-MC固定细胞20分钟。用0.5% Triton X-100进行透化处理15分钟。用4%山羊血清封闭1小时。
点击化学反应（Click Chemistry）：
使用Click-iT® Protein Reaction Buffer Kit，进行生物素-炔烃（Biotin-alkyne） 的点击化学反应。该步骤通过共价键将生物素标签连接到含有AHA的新生蛋白上。
邻位连接技术（PLA）：
使用抗生物素（anti-biotin）抗体和抗DBN抗体（一抗）共同孵育细胞。随后加入对应的PLA抗体探针，行连接与滚环扩增反应，产生可被荧光探针检测到的信号。
复染与成像：
用MAP2抗体标记树突，Hoechst标记细胞核。使用共聚焦显微镜（如Leica TCS SP8）采集Z-stack图像。使用Fiji（ImageJ） 软件及特定插件进行半自动化定量分析。
统计与MAP2信号重叠或在其附近（<1 µm）的PLA点（puncta），并将其总数除以MAP2标记的树突面积进行归一化，以消除细胞大小差异带来的影响。
4，总结与展望
FUNCAT-PLA技术通过在单细胞水平上实现新生蛋白的“可视化”，为研究蛋白质的动态生命史——从合成、运输到降解——提供了前所未有的时空分辨率。
在该研究中，FUNCAT-PLA不仅证实了DBN蛋白在神经元树突中的局部合成，更精确测定了其长达68小时的原位半衰期。这些发现为理解DBN蛋白在氧化应激下的稳定性调控机制提供了直接证据。FUNCAT-PLA技术正成为神经科学、细胞生物学等领域研究蛋白质动态与功能关联的利器。
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abs9179-500mL |
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