腺相关病毒/AAV包装技术的实验流程

AAV 包装核心是三质粒共转染 HEK293T 细胞，在无辅助病毒条件下原位组装出携带目的基因的重组 AAV 颗粒，兼具高安全性、低免疫原性、长期表达等优势，是体内外基因递送的主流工具。

维真生物采用的 AAV 包装系统为改良版的 AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System），该系统包括载体质粒（含有目的基因表达盒，其两端是 AAV2 的反向末端重复序列）、包装质粒（反式提供具有 AAV 复制和包装功能的蛋白 Rep 和 Cap）、辅助质粒（含有辅助病毒 Ad5 的重要元件 E1a、E1b、E2a、E4 等）和 1 株包装细胞（HEK293T cell）。

AAV 包装系统示意图

第一步 ：基因克隆 获取外源基因并将其构建至腺相关病毒载体。

第二步 ：将 携 带 外 源 基 因 的 重 组 质 粒 与 辅 助 质 粒 Ad Helper Vector 和 pAAV-rep/cap Vector 共转染包装细胞 HEK293T ，转染 72h 后细胞内产生大量的重组病毒。

第三步 ：分别收获培养基上清与细胞沉淀，用 PEG8000 沉淀培养基上清中的病毒，裂解细胞沉淀收毒，合并从细胞沉淀和上清中得到的病毒。

第四步：碘克沙醇法对病毒进行纯化。碘克沙醇是一种造影剂，已接受了临床检验。它具有非离子型、对细胞无毒和代谢惰性等优点，在病毒纯化方面应用广泛。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。利用碘克沙醇密度梯度离心，可以有效地将有感染力的病毒与空衣壳病毒及其他细胞杂质分离开，将有感染力的病毒由 10% 富集到 90% 以上。纯化完成后，再将收集到的病毒液置于超滤管中进行浓缩。

第五步： QC，包含病毒滴度及病毒纯度等检测。

AAV病毒滴度通过用QPCR的方法来检测的病毒滴度，得到的结果为包装得到的病毒颗粒数。其原理是用腺相关病毒基因组特异性引物进行实时定量PCR。在定量曲线的线性范围内，Ct值与已知拷贝数质粒的Ct值的比值即为病毒基因组的初始拷贝数。

AAV纯度通过灵敏的银染方法进行检测。AAV衣壳蛋白含有3种亚基VP1（82kDa）、VP2（72kDa）、VP3（62kDa），且所占比例为VP1：VP2：VP3=1:1:10。因此，一个纯度高的AAV在SDS-PAGE分析时仅显示三条带。下图是纯化后AAVs的银染结果：