基于经皮水分流失测量的本维莫德抑制特应性皮炎小鼠屏障功能研究进展
2024年7月，Takatsuki药物研究中心实验室Toshiki研究团队，在《BPB Reports》期刊发表了题为“Tapinarof, a Novel Topical Therapeutic Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist, Suppresses Atopic Dermatitis-like Skin Inflammation in Mice”的研究论文。该研究围绕非甾体小分子芳香烃受体（AhR）激动剂本维莫德展开，探究了其药理特性，以及在2,4-二硝基氟苯（DNFB）诱导的特应性皮炎（AD）样皮肤炎症小鼠模型中的应用效果。
摘要
本维莫德是一种非甾体类小分子芳香烃受体（AhR）激动剂，目前正被研发用于特应性皮炎（AD）。特应性皮炎是由2型辅助性T（Th2）细胞介导的慢性炎症性皮肤病，其特征为表皮分化受损和皮肤屏障功能障碍。有研究表明，本维莫德可通过激活芳香烃受体调控靶基因表达，改善皮肤屏障功能并发挥抗氧化作用。本研究探讨了本维莫德的药理特性，以及其在2,4-二硝基氟苯诱导的特应性皮炎样皮肤炎症小鼠中的疗效。在经T细胞激活剂刺激的人外周血单个核细胞中，本维莫德可诱导芳香烃受体激活的标志物细胞色素P4501A1（CYP1A1）的mRNA表达，也能诱导抗氧化酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化还原酶（NQO1）的mRNA表达，同时抑制Th2细胞因子白细胞介素-4（IL-4）的产生。在特应性皮炎样皮炎小鼠中，局部应用本维莫德可促进皮肤中Cyp1a1和Nqo1的表达，抑制IL-4的产生、耳廓肿胀及组织病理学改变，还能抑制作为皮肤屏障功能指标的经皮水分流失（TEWL）升高。这些结果表明，本维莫德可抑制特应性皮炎样皮肤炎症，其作用机制可能涉及抗氧化、抑制Th2细胞因子产生以及改善皮肤屏障功能等多种药理作用。
实验材料与仪器
实验材料
1. 化合物：本维莫德、他克莫司一水合物、二甲基亚砜（DMSO）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）；RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素G、链霉素；Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28；佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯；植物血凝素-L
2. 细胞：冷冻保存的人外周血单个核细胞
3. 实验动物：6周龄雌性BALB/c小鼠
使用仪器
数字测厚仪、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、实时荧光定量PCR系统、光学显微镜（用于组织病理切片观察）
实验过程
本研究分为体外人外周血单个核细胞实验和体内DNFB诱导的小鼠特应性皮炎样皮炎模型实验两部分，同时结合逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、组织病理学检查及相应统计学分析，具体过程如下：
体外人外周血单个核细胞（PBMCs）实验
1. 复苏冻存的人PBMCs，用RPMI-1640培养基重悬，以2×10⁵个细胞/孔接种于96孔板，加入2.0×10⁴个磁珠/孔的CD3/CD28 T细胞激活剂刺激2天，再加入不同浓度本维莫德继续培养24小时，后续用RNeasy Mini Kit提取总RNA，通过RT-qPCR检测CYP1A1和NQO1的mRNA表达。
2. 以相同方式接种PBMCs，加入PMA和PHA-L刺激，同时加入不同浓度的本维莫德，培养48小时后收集上清液，采用ELISA试剂盒检测IL-4水平；通过CellTiter-Glo 2.0 Assay检测细胞活力。
实验动物饲养与模型构建
1. 6周龄雌性BALB/c小鼠适应性喂养1周后用于实验。
2. 采用DNFB诱导小鼠特应性皮炎样皮炎：将25 μL 0.15% DNFB（丙酮/橄榄油3:1溶解）涂抹于小鼠左耳双侧，每3-4天一次，共15天内涂抹5次，构建半抗原诱导的慢性皮炎模型。
体内小鼠给药与指标检测
1. 给药方式：从首次DNFB涂抹当天开始，每日一次将20 μL/只的赋形剂（乙醇）、不同浓度本维莫德（0.01%、0.1%、1%）或0.1%他克莫司涂抹于小鼠左耳双侧，持续给药15天。
2. 耳廓肿胀检测：在第1、2、8、9、15、16天用数字测厚仪测量小鼠左耳厚度，计算与基线的差值，作为耳廓肿胀指标。
3. 经皮水分流失（TEWL）检测：第16天测量耳廓厚度后，用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪检测小鼠耳部皮肤的TEWL，评估皮肤屏障功能。
ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪
小鼠耳部皮肤的TEWL
4. 样本收集与检测：第16天检测完成后，麻醉并处死小鼠，取左耳分为三部分，分别用于基因表达、细胞因子检测和组织病理学评估。
组织病理学检查标准
对HE染色的耳部切片中心区域进行光学显微镜观察，从真皮炎症细胞浸润、表皮角化过度、痂皮形成三个维度，按“-（无）、±（极轻微）、+（轻微）、2+（中度）、3+（重度）”的标准进行分级评分。
实验结论
1. 本维莫德可在人外周血单个核细胞中激活芳香烃受体（AhR）通路，显著上调CYP1A1和抗氧化基因NQO1的mRNA表达，同时以浓度依赖的方式抑制Th2细胞因子IL-4的产生，表明其在体外具有抗氧化和抑制Th2细胞活化的作用。
2. 在DNFB诱导的小鼠特应性皮炎样皮炎模型中，局部应用0.01%及以上浓度的本维莫德可抑制小鼠耳廓肿胀，降低经皮水分流失（TEWL），改善皮肤屏障功能，且效果与阳性药0.1%他克莫司相当。
3. 组织病理学结果显示，本维莫德可剂量依赖性地减轻小鼠耳部皮肤的真皮炎症细胞浸润、表皮角化过度和痂皮形成等病理改变，缓解特应性皮炎样皮肤炎症。
4. 本维莫德可在小鼠病变皮肤中激活AhR通路，上调Cyp1a1和Nqo1的mRNA表达，同时抑制耳部组织中IL-4的升高，提示其通过激活AhR通路发挥抗Th2炎症、抗氧化作用，这是其抑制特应性皮炎样炎症的重要机制。
5. 特应性皮炎患者皮肤中CYP1A1表达降低、AhR表达升高，而低浓度（0.01%）本维莫德即可将小鼠病变皮肤中Cyp1a1和Nqo1的表达恢复至正常水平，说明低剂量局部应用本维莫德即可在皮肤组织中达到有效浓度，发挥作用。
6. 本维莫德的药理作用与现有糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂等特应性皮炎药物不同，其兼具改善皮肤屏障功能、抗氧化和抑制2型炎症的作用，尤其适用于对现有药物无应答或应答不佳的患者。
