反向找靶案例之中药单体和靶点的结合模式预测及验证
之前，小陶介绍了一种反向靶点发现算法——COMET，并使用了 Apiopaeonoside 和 Sciadopitysin 两种中药单体进行了操作演示。
接下来，让我们一起回顾一下之前的实验结果，并探讨后续推荐的实验思路。
结果分析思路
Apiopaeonoside 反向找靶的结果如下图所示：
假设本次实验发现 Apiopaeonoside 能治疗慢性阻塞性肺疾病、高血压，而预测的第一个靶点 Epoxide hydrolase 刚好和这两种疾病相关，所以，第一个靶点虽然打分（Probability）较低，但是，其仍然值得我们尝试后续的实验。
Sciadopitysin反向找靶结果如下图所示：
假设 Sciadopitysin 有治疗卵巢癌的效果，那么 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 打分虽然不如 Poly [ADP-ribose] polymerase-1 好，但是，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 和卵巢癌息息相关，所以，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 仍然是我们首先考虑的靶点。
后续实验验证
根据假设，目前已经得到了两个分子可能的靶点。后续一般可以用 分子亲合力实验 来证明小分子和蛋白确实是有结合的，比如SPR（表面等离子体共振技术）、MST（微量热泳动技术）。实验需要用到纯化蛋白和小分子单体及对应的仪器，蛋白和小分子陶术生物都可以提供，如果没有实验仪器，也可以找陶术生物来做验证实验！
除上述说的湿实验验证方法外，也可以尝试采用动力学作为补充实验。如黄以超团队在“Environmentally realistic dose of tire-derived metabolite 6PPD-Q exposure causes intestinal jejunum and ileum damage in mice via cannabinoid receptor-activated inflammation ”中所做实验一样。
分子动力学模拟
本次实验将以 Sciadopitysin 和 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 复合物结构为演示，采用 Amber24/Ambertool24 进行分子动力学模拟实验。本次实验细节内容将在陶术小课堂中展示。内容较多，会分步介绍，欢迎扫码关注~
蛋白体系的准备
首先，我们对得到的结构进行调整，我们需要注意以下7点：
A Non-Standard Residues
B Metals
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
D Solvent molecules or crystallization buffer
E Missing electron density (amino acids)
F Disulfide Bonds
G Protonation States
A Non-Standard Residues
Non-Standard Residues（非标准残基）是指PDB中20种天然氨基酸以外的其它氨基酸或者分子，包括辅因子（NADH、血红素等）、非标准氨基酸（羟脯氨酸等）、抑制剂/激动剂或底物。如果有任何非标准氨基酸，我们应该考虑如何对这些残基进行建模。对于不含金属或类金属的小有机分子，构建其结构和使用antechamber一样简单。对于更复杂的非标准残基，需要使用别的方法。
B Metals
金属的处理比较复杂，如果复合物结构中包含金属，应该仔细考虑如何对其建模。可以参考amber软件手册。或者在以下两个位置查看软件目前已有的金属力场$AMBERHOME/dat/leap/lib 和 $AMBERHOME/dat/leap/parm。
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
使用PDB晶体结构的时候，一定要好好阅读一下对应的文献，并注意任何重要的结构特征（比如二硫键）。还要注意用于解析结构的实验程序。有任何问题，都可以直接编辑PDB文件来修复。注意以下几点：
在某些情况下，溶剂或结晶缓冲液可能与蛋白质一起结晶，并包含在PDB文件中。因为我们后续采用显式溶剂体系，所以我们可以保留结晶水。PDB文件里有时会出现其他溶剂或磷酸盐。这些不会影响蛋白质的功能，因此可以将其去除。
E Missing electron density (amino acids)
有时，PDB缺少电子密度，但是，在实际实验中，必须要补全缺失的氨基酸。可以采用以下操作查看蛋白是否完整：
在晶体结构对应的论文中，可以了解结构的全貌，在VMD中看到蛋白质结构。Amber中对参与二硫键的半胱氨酸以CYX代替CYS。
G Protonation States
请记住，我们的最终目标是模拟现实，这可能不一定反映在PDB结构中。其中一个重要的例子是质子化状态。蛋白质含有几种非标准质子化状态的氨基酸。例如，天冬氨酸蛋白酶在其活性位点有一个质子化的天冬氨酸残基。在尝试模拟蛋白质之前，你应该知道你的蛋白质及其功能，你应该了解它是否需要任何非标准的质子化状态。
用X射线方法解析的的晶体结构不含氢，因为该方法无法解析。LEaP根据最佳氢键自动向这些结构中添加氢，同时遵循标准质子化状态。因此，如果不进行必要的重新命名更改，具有非标准质子化状态的氨基酸将被错误质子化。
例如，在天冬氨酸蛋白酶的PDB中，质子化的天冬氨酸将以Asp的重新命名，就像所有其他羧酸天冬氨酸一样。这将导致LEaP质子化，就像它是一种普通的天冬氨酸一样。为了防止这种情况，必须将非标准Asp的别名更改为ASH（质子化Asp的昵称）。使用正确的别名，LEaP将正确质子化您的氨基酸。表1显示了一些常见质子化状态的别名
Table 1. AMBER Resnames of Common Non-standard Protonation States
蛋白结构本身没有问题后，可以进行后续的操作。
小分子结构准备
准备好的小分子还在蛋白结构中，我们对其小分子进行准备，通过以下命令生成化合物的拓扑文件。
antechamber -i lig1.mol2 -fi mol2 -o lig.mol2 -fo mol2 -c bcc -s 2
其中antechamber是调用的程序，-i是输入，-f是格式，-o是输出，-c bcc是采用AM1-BCC电荷模型计算原子点电荷，-s 2是提供verbosity状态信息
parmchk2 -i lig.mol2 -f mol2 -o lig.frcmod
其中lig.frcmod是一个参数文件，可以加载到LEaP中以添加缺失的参数。这里它将包含所有缺失的参数。
tleap -f tleap_lig.in
对应的脚本可以从官网，或者私信获得。
复合物结构的准备
将复合物结构中化合物的编号改为LIG。
输入如下命令，添加离子中和体系电荷、加入水和0.15M的NaCl
tleap -f tleap_complex.in #隐式溶剂模型
tleap -f tleap_ion_water.in #显式溶剂模型
需要计算电荷，可以参考脚本。
体系弛豫
输入命令：
bash all_relax.scr
注意，对应的 min.in 脚本提前准备好，可以从官网下载也可以，另外脚本如果没有执行权限，记得用 chmod 加上权限。对应的解释可以在官网或者私信。
运行动力学
输入命令：
bash jobfile_production.sh
对应的md.in脚本可以从官网获取，也可私信。
目前，已经做好全部的动力学模拟实验，后续等待结果，最后。可以做一些分析，如下：
接下来，让我们一起回顾一下之前的实验结果，并探讨后续推荐的实验思路。
结果分析思路
Apiopaeonoside 反向找靶的结果如下图所示：
假设本次实验发现 Apiopaeonoside 能治疗慢性阻塞性肺疾病、高血压，而预测的第一个靶点 Epoxide hydrolase 刚好和这两种疾病相关，所以，第一个靶点虽然打分（Probability）较低，但是，其仍然值得我们尝试后续的实验。
Sciadopitysin反向找靶结果如下图所示：
假设 Sciadopitysin 有治疗卵巢癌的效果，那么 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 打分虽然不如 Poly [ADP-ribose] polymerase-1 好，但是，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 和卵巢癌息息相关，所以，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 仍然是我们首先考虑的靶点。
后续实验验证
根据假设，目前已经得到了两个分子可能的靶点。后续一般可以用 分子亲合力实验 来证明小分子和蛋白确实是有结合的，比如SPR（表面等离子体共振技术）、MST（微量热泳动技术）。实验需要用到纯化蛋白和小分子单体及对应的仪器，蛋白和小分子陶术生物都可以提供，如果没有实验仪器，也可以找陶术生物来做验证实验！
除上述说的湿实验验证方法外，也可以尝试采用动力学作为补充实验。如黄以超团队在“Environmentally realistic dose of tire-derived metabolite 6PPD-Q exposure causes intestinal jejunum and ileum damage in mice via cannabinoid receptor-activated inflammation ”中所做实验一样。
分子动力学模拟
本次实验将以 Sciadopitysin 和 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 复合物结构为演示，采用 Amber24/Ambertool24 进行分子动力学模拟实验。本次实验细节内容将在陶术小课堂中展示。内容较多，会分步介绍，欢迎扫码关注~
首先，我们对得到的结构进行调整，我们需要注意以下7点：
A Non-Standard Residues
B Metals
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
D Solvent molecules or crystallization buffer
E Missing electron density (amino acids)
F Disulfide Bonds
G Protonation States
A Non-Standard Residues
Non-Standard Residues（非标准残基）是指PDB中20种天然氨基酸以外的其它氨基酸或者分子，包括辅因子（NADH、血红素等）、非标准氨基酸（羟脯氨酸等）、抑制剂/激动剂或底物。如果有任何非标准氨基酸，我们应该考虑如何对这些残基进行建模。对于不含金属或类金属的小有机分子，构建其结构和使用antechamber一样简单。对于更复杂的非标准残基，需要使用别的方法。
B Metals
金属的处理比较复杂，如果复合物结构中包含金属，应该仔细考虑如何对其建模。可以参考amber软件手册。或者在以下两个位置查看软件目前已有的金属力场$AMBERHOME/dat/leap/lib 和 $AMBERHOME/dat/leap/parm。
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
使用PDB晶体结构的时候，一定要好好阅读一下对应的文献，并注意任何重要的结构特征（比如二硫键）。还要注意用于解析结构的实验程序。有任何问题，都可以直接编辑PDB文件来修复。注意以下几点：
- 第一列中的HEATM标签意味着这些残基默认情况下不会通过键与周围的氨基酸连接。查找/替换HEATM为“ATOM”，使序列连续。请确保保留ATOM后面的两个空格，以便其余列将排列整齐。
- 第二列是原子序号，不要修改
- 第三列是原子的名称。例如，CA是α-碳。因为蛋氨酸不含硒，如果存在，我们需要将这个原子变成硫。将原子名称从SE编辑为SD（蛋氨酸中硫原子的原子名称）。将最后一列中的SE也更改为S。
- 第四列是上面提到的残基名称。将所有MSE条目更改为MET。
在某些情况下，溶剂或结晶缓冲液可能与蛋白质一起结晶，并包含在PDB文件中。因为我们后续采用显式溶剂体系，所以我们可以保留结晶水。PDB文件里有时会出现其他溶剂或磷酸盐。这些不会影响蛋白质的功能，因此可以将其去除。
E Missing electron density (amino acids)
有时，PDB缺少电子密度，但是，在实际实验中，必须要补全缺失的氨基酸。可以采用以下操作查看蛋白是否完整：
- 使用VMD显示蛋白质骨架，并寻找任何缺失。
- 或者，您可以在PDB文件中查找缺失的残基。
在晶体结构对应的论文中，可以了解结构的全貌，在VMD中看到蛋白质结构。Amber中对参与二硫键的半胱氨酸以CYX代替CYS。
G Protonation States
请记住，我们的最终目标是模拟现实，这可能不一定反映在PDB结构中。其中一个重要的例子是质子化状态。蛋白质含有几种非标准质子化状态的氨基酸。例如，天冬氨酸蛋白酶在其活性位点有一个质子化的天冬氨酸残基。在尝试模拟蛋白质之前，你应该知道你的蛋白质及其功能，你应该了解它是否需要任何非标准的质子化状态。
用X射线方法解析的的晶体结构不含氢，因为该方法无法解析。LEaP根据最佳氢键自动向这些结构中添加氢，同时遵循标准质子化状态。因此，如果不进行必要的重新命名更改，具有非标准质子化状态的氨基酸将被错误质子化。
例如，在天冬氨酸蛋白酶的PDB中，质子化的天冬氨酸将以Asp的重新命名，就像所有其他羧酸天冬氨酸一样。这将导致LEaP质子化，就像它是一种普通的天冬氨酸一样。为了防止这种情况，必须将非标准Asp的别名更改为ASH（质子化Asp的昵称）。使用正确的别名，LEaP将正确质子化您的氨基酸。表1显示了一些常见质子化状态的别名
| Non-standard Protonation Form | AMBER Resname |
| Protonated/uncharged Asp | ASH |
| Protonated/uncharged Glu | GLH |
| Deprotonated/uncharged Lys | LYN |
| His protonated at epsilon position | HIE |
| His protonated at delta position | HID |
| Charged His (protonated at both positions) | HIP |
| Deprotonated Cys or Cys bound to a metal | CYM |
| Cys involved in disulfide bridge | CYX |
蛋白结构本身没有问题后，可以进行后续的操作。
小分子结构准备
准备好的小分子还在蛋白结构中，我们对其小分子进行准备，通过以下命令生成化合物的拓扑文件。
antechamber -i lig1.mol2 -fi mol2 -o lig.mol2 -fo mol2 -c bcc -s 2
其中antechamber是调用的程序，-i是输入，-f是格式，-o是输出，-c bcc是采用AM1-BCC电荷模型计算原子点电荷，-s 2是提供verbosity状态信息
▲输出之后对应的界面
▲完成的界面
parmchk2 -i lig.mol2 -f mol2 -o lig.frcmod
其中lig.frcmod是一个参数文件，可以加载到LEaP中以添加缺失的参数。这里它将包含所有缺失的参数。
tleap -f tleap_lig.in
对应的脚本可以从官网，或者私信获得。
复合物结构的准备
将复合物结构中化合物的编号改为LIG。
▲复合物结构的修改
输入如下命令，添加离子中和体系电荷、加入水和0.15M的NaCl
tleap -f tleap_complex.in #隐式溶剂模型
tleap -f tleap_ion_water.in #显式溶剂模型
需要计算电荷，可以参考脚本。
体系弛豫
输入命令：
bash all_relax.scr
注意，对应的 min.in 脚本提前准备好，可以从官网下载也可以，另外脚本如果没有执行权限，记得用 chmod 加上权限。对应的解释可以在官网或者私信。
运行动力学
输入命令：
bash jobfile_production.sh
对应的md.in脚本可以从官网获取，也可私信。
目前，已经做好全部的动力学模拟实验，后续等待结果，最后。可以做一些分析，如下：
动力学结果样图
