内毒素检测（光度法）的原理及操作步骤

一，动态显色法原理

革兰氏阴性细菌内毒素催化了LAL中酶原的活化 。初始活化速率由内毒素的浓度决定。活化后的酶催化了无色底物 Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA释放出pNA。在整个孵育过程中，用光度法连续测量405nm处的游离pNA。通过将其反应时间与标准曲线比较，计算出样品中的内毒素浓度。

酶原 内毒素 凝固酶

底物 + H2O 酶肽 肽 + pNA
 

二，动态浊度法原理

浊度法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来检测内毒素含量的鲎试验法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。随着凝胶的形成，反应液吸光值的增加、OD值增加速率和内毒素的浓度呈正相关。
 

三，光度法检测所需主要设备、材料

试剂

– 鲎试剂（LAL）（Kinetic-QCL™ 或 PYROGENT™-5000 试剂）

– 内毒素工作标准品 (CSE)

– LAL溶解缓冲液（用于PYROGENT™-5000动态浊度法LAL 试验）

– LAL 试剂检查用水（即LRW）(# W50-640, W50-100, W50-500)

器具

– 玻璃稀释管(# N207)

– 独立包装的血清吸管（选购）

– 标签

– 96-微孔板 (# 25-340)

– 试剂槽(# 00190035)

请使用经内毒素试验验证合格的无热原器具。

设备和软件

– 八道移液器

– 光吸收酶标仪

– WinKQCL™软件

– 移液器

– 计时器

– 漩涡混合器

 

四，操作步骤

本指南分步描述了如何进行传统动态法鲎试剂（以下简称LAL）试验。试验开始前，先使试剂瓶温度与室温相同。还应打开孵育酶标仪，并在WinKQCL软件中创建微孔板模板。

五，注意事项

– 使用配套的LAL和 CSE 试剂

– 建议勿使用塑胶管稀释内毒素

– 遵循所有关于内毒素漩涡震荡次数的建议

– 使用经内毒素试验验证合格的无热原器具

– 使用前，先使试剂温度与室温保持相同

– 不要对LAL进行漩涡震荡

– 将试剂放入96-微孔板的孔中时，避免产生气泡

– 不要污染样品、标准品、LRW 和器具

– 应正确安装、验证并维护设备仪器