MeRIP-seq揭示衰老和神经变性过程中m6A RNA甲基化修饰的保守下调机制
2023年02月22日，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)期刊发表了题为“Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts”的研究论文，该研究通过对小鼠和人的健康脑组织和AD（阿尔茨海默病，Alzheimer’s disease）患病脑组织进行MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR等实验，揭示m6A修饰减少与突触蛋白合成受损相关。
标题：Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts（衰老和神经变性过程中m6A RNA修饰减少与突触转录本变化相关）
时间：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影响因子：IF 12.779
技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
样本实验：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）调控mRNA代谢。尽管已有研究表明m6A修饰与哺乳动物大脑的发育和认知相关，但m6A在突触可塑性中（尤其是在认知衰退期间）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）绘制了年轻（young）和老年（aged）小鼠海马亚区CA1、CA3和齿状回以及前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表观转录组图谱，结果表明老年小鼠的m6A水平降低。对认知完整的健康人类和阿尔茨海默病（AD）患者的扣带皮层（CC）脑组织的MeRIP-seq比较分析显示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在与突触功能相关的转录本中发现老年小鼠和AD患者大脑常见的m6A变化，包括钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA选择性谷氨酸受体1（Glua1），邻近连接试验表明，m6A水平降低导致突触蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）减少。此外m6A水平降低还会导致突触功能受损。本研究结果表明，m6A RNA甲基化调控突触蛋白合成，并可能在与衰老和AD相关的认知衰退中发挥作用。
研究意义：
本研究描述了小鼠和人类的健康和AD患病大脑中的全基因组m6A表观转录组图谱。数据分析表明，大量的m6A转录本保守，且这些转录本集中在突触处富集、与突触过程的调控有关。研究人员在AD小鼠模型的脑组织和患有阿尔茨海默病患者的扣带回脑组织中检测到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在机制水平上证明了m6A修饰减少与受损的突触蛋白合成相关。
结果图形
（1）成年小鼠大脑中的m6A图谱
本研究通过表征健康成年小鼠大脑中m6A RNA修饰图谱来开始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月龄（young）野生型（WT）小鼠的大脑，以获得海马亚区CA1、CA3和齿状回（DG）以及前扣带皮层（ACC），实验所用样本与学习和记忆过程以及认知疾病有关。对样本进行甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）以鉴定年轻成年小鼠的亚区域特异性表观转录组图谱。
图1：成年小鼠大脑的m6A RNA甲基化图谱。
这些数据表明常见的m6A转录本可能在突触处特异性富集，为了进一步深入研究，作者利用最近发表的包含高可信度的海马突触RNAome数据集，并将其与海马表观转录组数据进行比较分析。在这两个数据集中观察到突触在mRNA中甲基化转录本中的强富集，超过70%的突触体和64%的微流体室转录组中至少有一个m6A peaks。基于本研究数据列表与其他数据库的交叉比较分析，表明m6A RNA修饰是成年大脑突触功能的关键调控过程。
（2）成年人脑中的m6A甲基化修饰揭示了与突触功能相关的转录本保守富集
接下来，作者对5个死后认知未衰退健康人脑的扣带皮层（CC）组织进行MeRIP-seq，以描绘人脑转录本中的m6A分布。
（3）小鼠认知衰退模型和人类AD患者脑组织中的m6A RNA变化
通过MeRIP-seq数据证明了通过m6A修饰调控突触组织、功能和可塑性可能是成年哺乳动物大脑中的保守机制。为了进一步探索这一点，作者选择鼠年龄相关记忆障碍作为认知衰退模型系统研究了m6A修饰变化机制。
图4：表观转录组学在神经变性和衰老中的变化。
（4）m6A水平降低影响可塑相关蛋白CAMKII的合成
本研究通过MeRIP-seq等实验阐明了m6A RNA修饰在年轻和老年小鼠大脑以及认知完整的人类和AD患者大脑中的功能，为该领域的进一步研究提供了重要资源。由于在大脑衰老和AD中观察到突触基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化机制可能是预防认知衰退的颇具前景的策略。
参考文献：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
时间：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影响因子：IF 12.779
技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
样本实验：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）调控mRNA代谢。尽管已有研究表明m6A修饰与哺乳动物大脑的发育和认知相关，但m6A在突触可塑性中（尤其是在认知衰退期间）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）绘制了年轻（young）和老年（aged）小鼠海马亚区CA1、CA3和齿状回以及前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表观转录组图谱，结果表明老年小鼠的m6A水平降低。对认知完整的健康人类和阿尔茨海默病（AD）患者的扣带皮层（CC）脑组织的MeRIP-seq比较分析显示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在与突触功能相关的转录本中发现老年小鼠和AD患者大脑常见的m6A变化，包括钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA选择性谷氨酸受体1（Glua1），邻近连接试验表明，m6A水平降低导致突触蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）减少。此外m6A水平降低还会导致突触功能受损。本研究结果表明，m6A RNA甲基化调控突触蛋白合成，并可能在与衰老和AD相关的认知衰退中发挥作用。
研究意义：
本研究描述了小鼠和人类的健康和AD患病大脑中的全基因组m6A表观转录组图谱。数据分析表明，大量的m6A转录本保守，且这些转录本集中在突触处富集、与突触过程的调控有关。研究人员在AD小鼠模型的脑组织和患有阿尔茨海默病患者的扣带回脑组织中检测到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在机制水平上证明了m6A修饰减少与受损的突触蛋白合成相关。
结果图形
（1）成年小鼠大脑中的m6A图谱
本研究通过表征健康成年小鼠大脑中m6A RNA修饰图谱来开始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月龄（young）野生型（WT）小鼠的大脑，以获得海马亚区CA1、CA3和齿状回（DG）以及前扣带皮层（ACC），实验所用样本与学习和记忆过程以及认知疾病有关。对样本进行甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）以鉴定年轻成年小鼠的亚区域特异性表观转录组图谱。
图1：成年小鼠大脑的m6A RNA甲基化图谱。
- 实验方案。
- 上：根据input计算海马CA1、CA3和DG区域中m6A甲基化转录本百分比饼图。下：注释的转录区域的m6A peaks位点。百分比由m6A peaks总数计算。
- 海马亚区mRNA上m6A peaks分布吉他图。
- 海马亚区m6A甲基化转录本Venn图。
- 所有海马区域中检测到的m6A甲基化转录本GO富集分析
- 上：在ACC转录组中m6A RNA甲基化的分布。下：注释的转录本区域的m6A peaks位点。
- ACC中mRNA的m6A peaks分布吉他图
- 比较海马和ACC中m6A常见甲基化转录本Venn图。
- 海马和ACC中常见m6A甲基化转录本中突触特异性GO富集分析Sunburst图。
- 从海马突触体或从微流体室（microfluid chamber）中分离突触中获得的RNA-seq数据集中m6A甲基化转录本百分比饼图。ACC-前扣带皮层，DG-齿状回，5‘UTR-5'非翻译区，3’UTR-3'非翻译区，CDS-编码序列，ncRNA-非编码RNA。
这些数据表明常见的m6A转录本可能在突触处特异性富集，为了进一步深入研究，作者利用最近发表的包含高可信度的海马突触RNAome数据集，并将其与海马表观转录组数据进行比较分析。在这两个数据集中观察到突触在mRNA中甲基化转录本中的强富集，超过70%的突触体和64%的微流体室转录组中至少有一个m6A peaks。基于本研究数据列表与其他数据库的交叉比较分析，表明m6A RNA修饰是成年大脑突触功能的关键调控过程。
（2）成年人脑中的m6A甲基化修饰揭示了与突触功能相关的转录本保守富集
接下来，作者对5个死后认知未衰退健康人脑的扣带皮层（CC）组织进行MeRIP-seq，以描绘人脑转录本中的m6A分布。
图2：小鼠和人之间保守的m6A修饰。
- 上：根据input计算人CC中m6A甲基化转录本百分比饼图。下图：注释的转录区域m6A peaks位点。
- 人CC中mRNA上m6A修饰分布吉他图
- m6A peaks的motif分析鉴定出m6A DRACH共有motif（D=A、T或G，R=A或G，H=A、T或C）。
- 左：分别在人/小鼠中已知同源物的小鼠/人基因Doughnut图，用于比较不同物种的甲基化转录本。右：比较成年小鼠ACC和人CC中m6A甲基化同源转录本的Venn图。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化转录本的GO分析（生物学过程）。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化转录本GO富集分析的突触特异性Sunburst图。
- 在小鼠ACC和人CC（CAMKIIb/CAMKIIb）中的Camk2b沿同源转录本3'端保守的m6A修饰代表性覆盖轨迹。轨迹根据相应input和文库大小归一化的m6A RIP覆盖值。以RPM为单位刻度。
- 人CC特异性m6A甲基化转录本的GO分析。
- 与突触RNA相比，保守转录本（通常在小鼠和人类中检测到）与人和小鼠特异性转录本之间相关联的优势比热图。
（3）小鼠认知衰退模型和人类AD患者脑组织中的m6A RNA变化
通过MeRIP-seq数据证明了通过m6A修饰调控突触组织、功能和可塑性可能是成年哺乳动物大脑中的保守机制。为了进一步探索这一点，作者选择鼠年龄相关记忆障碍作为认知衰退模型系统研究了m6A修饰变化机制。
图3：老年小鼠大脑中的组织特异性m6A变化
- 实验方案。
- 在相应的脑亚区中检测到的差异表达和差异甲基化基因数量条形图，对FC和调整后的P值应用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 在分析的大脑亚区中m6A甲基化转录本百分比饼图，其中包含在衰老过程中仅甲基化水平降低（低甲基化）和仅甲基化水平增加（高甲基化）的peaks，或m6A peaks减少和增加（混合）的混合peaks。
- 所研究大脑区域转录本中显著低甲基化m6A peaks的注释分布条形图。
- 比较海马亚区和ACC的低甲基化转录本Venn图。深红色矩形表示在所有海马亚区检测到的87个转录本。相应的右/上图显示了这些转录本的GO富集分析（生物过程）。黑色矩形表示海马和ACC中通常低甲基化的33个转录本，右/下图显示了相应的GO富集分析。
- 两个差异甲基化基因（低甲基化和高甲基化）的qPCR验证。图中显示了MeRIP-seq和MeRIP–qPCR检测到的甲基化FC。MeRIP-seq数据列表显示了FDR的平均FC，由ExomePeak计算。MeRIP-qPCR数据列表显示了每个条件四个独立重复的平均值±SEM。统计显著性由Student's t检验确定，P值显示在比较值上方。
图4：表观转录组学在神经变性和衰老中的变化。
- AD组与对照组样品中差异表达和差异m6A甲基化转录本数量条形图，对FC和调整后的P值应用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 与对照组相比，AD样本中低甲基化、高甲基化和混合转录本的比例饼图。
- 与对照组相比，AD中m6A低甲基化转录本（FC>1.5）的GO富集分析。
- AD中低甲基化转录本m6A peaks分布条形图。
- 比较老年小鼠ACC和人AD患者CC中显著低甲基化转录本Venn图，突出显示的是CaMKII亚型。
- KEGG通路LTP图（hsa04720）。紫色突出显示的是AD患者的老年小鼠ACC和人CC中通常低甲基化的转录本。CAMKII也属于该组，但由于其低甲基化通过qPCR（H）验证，因此以红色突出显示。
- 在年轻与老年小鼠、健康对照与AD患者中的人CC大脑中CamkII亚型的m6A低甲基化条形图。每条代表最接近终止密码子的相应转录本的3‘UTR中的甲基化位点。
- qPCR验证不同CamkII亚型的3‘UTR中低甲基化区域。图中显示通过MeRIP-seq和MeRIP-qPCR检测的m6A甲基化中的FC。误差条显示6/4（young/aged）独立重复的平均值±SEM；P值显示在比较上方。统计显着性通过Student's t检验和Welch对不等方差的校正进行评估。
（4）m6A水平降低影响可塑相关蛋白CAMKII的合成
图5：m6A水平变化影响CAMKII突触蛋白合成
- 用靶向Mettl3（Mettl3 KD）或相应对照寡核苷酸（对照）的GAPmer处理神经元培养物中Mettl3表达的qPCR结果条形图。
- 代表性的immunoblot分析显示METTL3蛋白水平响应于GAPmer介导的METTL3敲除。
- B的量化。
- GAPmer介导的Mettl3敲除后的主要m6A水平。A、C和D中的图表显示了每个条件的平均值±SEM。每个数据点代表一个独立的复制。
- 用于量化原代神经元中CAMKII合成的puro-PLA标记示意图。
- 用对照或Mettl3 KD GAPmers处理的原代海马神经元的代表性图像。（比例尺，20μm）CAMKII-PLA信号显示为绿色，SYP显示为红色，Map2显示为蓝色。右图显示了代表性树突的高倍图像（比例尺，10μm）。箭头表示突触附近的CAMKII合成位点。
- 处理的神经元中检测到的PLA点总数的Violin图。阴性对照（NegC）在PLA前未经嘌呤霉素处理。
- 比较对照和Mettl3 KD处理的神经元中突触定位的CAMKII-PLA点的Violin图。G和H中的图显示三个独立实验的平均值；每个实验对7-13个神经元进行成像和分析。四分位数用灰线标记。
- 微流体室中生长的原代神经元突触室中归一化CAMKIIa mRNA水平。I中的点代表神经元培养体的独立重复。
本研究通过MeRIP-seq等实验阐明了m6A RNA修饰在年轻和老年小鼠大脑以及认知完整的人类和AD患者大脑中的功能，为该领域的进一步研究提供了重要资源。由于在大脑衰老和AD中观察到突触基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化机制可能是预防认知衰退的颇具前景的策略。
参考文献：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
