细胞复苏技术知识分享

各位老师在进行细胞培养时，肯定会遇到以下问题：

     ● 细胞越长越多
     ● 买的细胞比较贵重
     ● 节假日无法照看细胞
     ● 实验不顺畅需要重新进行实验

这时，我们就需要适当的保存一些细胞，也就是冻存细胞。 
 

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 

在不加任何保护剂的条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。 如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

 

   细胞冻存复苏遵循的原则是：慢冻快融慢冻大家可参考之前的文章：   今天我们来聊聊，细胞复苏时需要注意的那些事儿。细胞复苏的原则：快速融化必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

 

01、实验前准备

     1. 将水浴锅提前预热至37℃
     2. 细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。
     3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

02、取出冻存管

     1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。
     2. 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

03、迅速解冻

     1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
     2. 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

04、平衡离心

     1. 用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

05、制备细胞悬液

     1. 吸弃上清液。
     2. 向离心管内加入10ml完全培养液，吹打制成细胞悬液。
     3. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

06、细胞计数

     1. 细胞浓度以5×105/ml为宜。

07、培养细胞

     1. 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO₂的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

08、记录复苏日期

 

“ Note

注意事项

细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出现问题的部分，因此我们帮您总结以下几点注意事项，帮助您更好的进行实验操作：     

     1. 注意无菌操作。
     2. 取细胞的过程中可能会接触液氮，一定注意带好防冻手套，护目镜。
     3. ☆此项尤为重要，如果冻存管密封不严，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时，在水浴中摇晃，冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸，所以，一定要戴保护眼镜和手套。
     4. 应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外，细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
     5. 细胞复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮或-70℃水箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅中进行解冻。
     6. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少其对细胞的损伤。
     7. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液，经验总结，培养基越少细胞越容易贴附。
     8. 复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
     9. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果加培养基的太少，DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1％。所以如果冻存液的浓度是10％DMSO，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。  

 

 初学者易犯错误

     1. 水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。
     2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
     3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
     4. 一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

 

解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡，像水土不服一样。

 

结果分析

判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。

如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。

本文部分内容来源：百度文库

 

 

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