荧光素标记抗体实用小技巧
荧光抗体是将抗血清，经纯化成抗体IgG成分，采用直接标记方法，将异硫氰酸荧光素（FITC美国sigma产品）及异硫氰酸罗达明荧光素（红色）（RBITC, sigma产）共价交联到抗体（IgG）分子的赖氨酸分子上，并经过纯化、蛋白量、FITC、RBITC浓度及效价鉴定而制成。免疫学实验中，我们经常需要将抗体标记上酶或者荧光素，大部分科研工作者如何下手，参照一些文献的方法和步骤做出来的结果往往不尽如人意，往往让实验人员畏而束手。
下面总结了抗体的标记一些小技巧：
第一，你需要了解你所需要的标记物的特性，选择合适的带活性标记物（HRP酶，生物素或者荧光染料），对活性的标记物要清楚其溶解性(脂溶性还是水溶性)、保存要求、活性位点化学反应特性等等。有些荧光染料有较为苛刻的要求，一定要防潮，一旦遇到水活性键在几分钟内或几小时内完全失活，脂溶性的染料一般用DMSO,DMF类有机溶剂溶解，一定要确保其不含水分。在保存上所有荧光染料都要求避光，使用和反应过程都要尽量避光。活性染料的活性键与抗体的反应基团必须要清楚，这样才能保证给其提供最适宜的反应条件。
第二，关于抗体。抗体的纯度要好，特异性和溶解性也要好，尽量不要有变性抗体和沉淀物。其溶解的溶液环境最好为无机盐(比如PBS环境)，处于一个合适稳定的PH环境，溶液中不含有游离的可干扰反应的官能团，比如，大部分的活性染料是与抗体的伯氨基（-NH2）反应，所以溶液中一定不能含有带伯氨基的化学物质(比如游离的氨基酸，游离肽，或者Tris之类的)，我们纯化抗体过程需要大量使用这些试剂，在后期往往没有去除干净。也许有的小伙伴会说，我用PBS透析了很多次；其实透析次数不能说明问题，也不能说明你就一定透析干净；怎么办呢？加个标准参照，一些非活性的染料都可以作为参照指示剂，实在找不到合适的染料，加点蓝墨水也可以，一般来说如果可以精确计算，颜料的摩尔数是预除去小分子的20倍为宜，透析或者超滤到看不到颜色，这个基本上可以保证您对游离小分子去除干净。
第三，标记反应过程，标记反应的条件要是最适合于标记物化学反应的，而于此同时又不能损伤抗体的活性。对于标记缓冲液中同样不能有游离基团或者抑制剂干扰反应；标记温度和时长也要合理控制；标记物与抗体的比例要合适，不是越多越好。整个标记反应过程要避光，所使用接触的所有的容器枪头一定要干净。
最后，标记反应完之后，残留的未标记的标记物、有机溶剂一定要去除干净（去除干净的标准同抗体溶液环境中游离干扰物去除方法），同时，PH要调整到抗体最适的环境。必要的时候加入30&左右甘油和保护性的蛋白，分装成小份-20℃保存。
下面总结了抗体的标记一些小技巧：
第一，你需要了解你所需要的标记物的特性，选择合适的带活性标记物（HRP酶，生物素或者荧光染料），对活性的标记物要清楚其溶解性(脂溶性还是水溶性)、保存要求、活性位点化学反应特性等等。有些荧光染料有较为苛刻的要求，一定要防潮，一旦遇到水活性键在几分钟内或几小时内完全失活，脂溶性的染料一般用DMSO,DMF类有机溶剂溶解，一定要确保其不含水分。在保存上所有荧光染料都要求避光，使用和反应过程都要尽量避光。活性染料的活性键与抗体的反应基团必须要清楚，这样才能保证给其提供最适宜的反应条件。
第二，关于抗体。抗体的纯度要好，特异性和溶解性也要好，尽量不要有变性抗体和沉淀物。其溶解的溶液环境最好为无机盐(比如PBS环境)，处于一个合适稳定的PH环境，溶液中不含有游离的可干扰反应的官能团，比如，大部分的活性染料是与抗体的伯氨基（-NH2）反应，所以溶液中一定不能含有带伯氨基的化学物质(比如游离的氨基酸，游离肽，或者Tris之类的)，我们纯化抗体过程需要大量使用这些试剂，在后期往往没有去除干净。也许有的小伙伴会说，我用PBS透析了很多次；其实透析次数不能说明问题，也不能说明你就一定透析干净；怎么办呢？加个标准参照，一些非活性的染料都可以作为参照指示剂，实在找不到合适的染料，加点蓝墨水也可以，一般来说如果可以精确计算，颜料的摩尔数是预除去小分子的20倍为宜，透析或者超滤到看不到颜色，这个基本上可以保证您对游离小分子去除干净。
第三，标记反应过程，标记反应的条件要是最适合于标记物化学反应的，而于此同时又不能损伤抗体的活性。对于标记缓冲液中同样不能有游离基团或者抑制剂干扰反应；标记温度和时长也要合理控制；标记物与抗体的比例要合适，不是越多越好。整个标记反应过程要避光，所使用接触的所有的容器枪头一定要干净。
最后，标记反应完之后，残留的未标记的标记物、有机溶剂一定要去除干净（去除干净的标准同抗体溶液环境中游离干扰物去除方法），同时，PH要调整到抗体最适的环境。必要的时候加入30&左右甘油和保护性的蛋白，分装成小份-20℃保存。
