不同采血管和样本冻融次数对血液生物标志物检出浓度的影响

Simoa单分子免疫阵列分析技术是目前市面上最灵敏的蛋白分子检测技术，其可以检测单个蛋白分子，灵敏度达到飞克级别。在肿瘤、神经、感染免疫、心血管、炎症、生殖、眼科等领域都有着广泛应用。

在血液样本的收集制备和储存过程中，往往会涉及不同采血管的使用和样本冻融。来自于瑞典、美国、伦敦的科学家们针对这个问题在阿尔兹海默症相关的血液生物标志物上做了验证研究，文章发表于Alzheimer’s & dementia（IF=14.48）。


Effects of pre-analytical procedures on blood biomarkers for Alzheimer's pathophysiology, glial activation, and neurodegeneration
Alzheimer’s & dementia (Amsterdam, Netherlands). 2021; 13:e 12168；IF=14.48

实验方法    

本研究测试了使用不同采血管（乙二胺四乙酸[EDTA]、血清、肝素锂[LiHep]和柠檬酸盐）收集样本以及样本反复冻融对阿尔茨海默症（AD）、神经胶质细胞活化和神经元损伤等疾病的血液生物标记物浓度水平的影响。采用单分子免疫阵列分析技术（Simoa HD-X平台）检测Aβ42、Aβ40、p-tau181、胶质原纤维酸性蛋白、t-tau、NfL、pNfH。

实验结果    

图1. 本研究设计示意图

 

表1. EDTA、血清、LiHep和柠檬酸盐等类型采血管收集的样本中的生物标志物的平均浓度

图2. 图示不同采血管收集的8个样本中8种生物标志物的浓度。（A）NfL，（B）pNfH，（C）GFAP，（D）Aβ42，（E）Aβ40，（F）Aβ42/40，（G）t-tau和（H）p-tau181。每种颜色代表一个样本。灰色框表示八个样本的浓度平均值（pg/mL） *P<0.05，**P<0.01，***P<.001


图3. 图示反复冻融对EDTA血浆和血清生物标志物浓度的影响。（A）NfL，（B）pNfH，（C）GFAP，（D）Aβ42，（E）Aβ40，（F）Aβ42/40，（G）t-tau和（H）p-tau181。每组的第1图和第2图为EDTA血浆，第3图和第4图为血清；第1图和第3图显示了四次反复冻融的30个样本的生物标志物浓度（pg/mL），红色菱形表示每次冻融循环的平均值；第2图和第4图表示与冻融1次相比，冻融2次至4次时30个样本的生物标志物浓度的百分比。* P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
使用不同类型采血管收集的样本中的大多数生物标志物的绝对浓度存在显著差异。其中使用LiHep采血管收集的样本中，所有生物标志物的浓度平均值最高。Aβ42/40（r=0.63-0.86）和血清t-tau（r=0.46-0.64）与采血管类型的相关性较弱。反复冻融对血清Aβ和t-tau水平有显著影响（P<0.0001）。冻融循环4次后，EDTA Aβ40和EDTA P-tau181浓度水平略有下降（P<0.05）。

实验结论    

1、含有EDTA、血清、LiHep和柠檬酸盐的采血管并不全部适用于本研究所涉及的生物标志物，因为检测得到的生物标志物的绝对浓度显著不同，在对血液生物标志物进行研究时，应使用相同类型的采血管；
2、反复冻融少于四次时，NfL和pNfH浓度无明显变化；

3、血清样本并不适用于Aβ42、Aβ40和t-tau的检测，因为冻融容易引起血清中这三个蛋白的浓度变化；

4、检测EDTA Aβ40时应避免超过3次的冻融循环，但可通过Aβ42/40比值进行补偿；

5、检测p-tau181时应避免超过3次的冻融循环。