mosquito单细胞测序应用|Nature Biotech：单细胞测序技术系统性比较

西班牙国家基因组分析中心、巴塞罗那科学与技术学院的研究团队在《Nature Biotechnology》发表题为Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects的文章，从检测灵敏度、细胞检出类型、时间和花费成本等方面，对13种单细胞RNA测序技术进行了系统性比较。为研究人员根据自己的实际应用的需求，选择使用不同的单细胞RNA-seq方法提供了指导。

实验设计
研究人员将来自3个物种，5种类型（图1左上）的细胞进行混合后，平均分成13份，分别进行不同方法的单细胞测序。这些样本具有如下特征：

· 包含多种细胞类型；

· 某些细胞非常相似，基因表达只有细微的差异；

· 细胞具有可追踪的标志物；

· 包含不同物种的细胞。

实验结果
可以看出低通量plate-based的Quarts-seq2, CEL-seq2, Smart-seq2方法在灵敏度上还是远强于其他高通量的方法，其中Quarts-seq2对三种细胞类型的基因检出都是最高的， CEL-seq2的表现仅次于Quarts-seq2，但是优于其它方法。
 
Boxplots displaying the minimum, the first, second and third quantiles, and the maximum number of genes detected across the protocols, in down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells. Cell identities were defined by combining the clustering of each dataset and cell projection on to the reference.

对于标记基因的检测，不同的方法检测结果大不相同，Quartz-seq2和Smart-seq2对所有细胞标记基因都能检测出高表达水平，说明这两种方法具有更高的细胞类型识别能力。
  d, Average log(expression) values of cell-type-specific reference markers for down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells. e,Average log(expression) values of cell-type-specific reference markers for down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells.

对于细胞图谱项目，往往由于使用不同的测序方法会生成多套数据，文章还测试了先把所有数据整合在一起然后进行聚类分析细胞类型，考察了数据整合分析的可行性。

 
Integration of sc/snRNA-seq methods. a–d, UMAP visualization of cells after integrating technologies for 18,034 human (a,b) and 7,902 mouse (c,d) cells. Cells are colored by cell type (a,c) and sc/snRNA-seq protocol (b,d). e,f, Barplots showing normalized and method-corrected (integrated) expression scores of cell-type-specific signatures for human HEK293T cells, monocytes, B cells (e), and mouse secretory and TA cells (f). Bars represent cells and colors methods. g,h, Evaluation of method integratability in human (g) and mouse (h) cells. Protocols are compared according to their ability to group cell types into clusters (after integration) and mix with other technologies within the same clusters. Points are colored by sequencing method.

 

这篇文章的信息量非常大，作者还提到了诸如Smart-seq2这样的成本较高的单细胞测序方法，可以通过微缩化的方式去降低成本，这点在SPT Labtech的mosquito纳升级液体工作站上可以完美实现。
 

通过体外转录方式扩增cDNA比基于PCR的方法产生的PCR偏好性更小，这也解释了CEL-seq2的在检测灵敏度等方面都表现出的良好性能。
 

文章中使用的13种scRNA-seq方法包括 CEL-seq2、MARS-seq、Quartz-seq2、gmcSCRB-seq、Smart-seq2、ddSEQ、ICELL8、C1HT-small、C1HT-medium、Chromium、Chromium (sn)、Drop-seq、inDrop。这也是大家耳熟能详的单细胞测序方法。

值得一提的是文章中使用的CEL-seq2检测方法，使用了mosquito进行5倍微缩化的CEL-seq2单细胞cDNA合成，这也是德国马克斯普朗克研究所优化的CEL-Seq2 protocol（mCEL-seq2）。使用mosquito添加160nL裂解液和240nL RT mix，cDNA第一链合成仅在400nL体系内进行。
 

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